利用RT-PCR方法克隆到包括有全部编码序列和部分5′、3′端非编码序列的人G-CSF cDNA,并通过核苷酸测序得到证实。将其定向克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建成人G-CSF的重组逆转录病毒表达载体pLGSN。体外经CRE和CRIP细胞的两次包装,病毒滴度达到了临床应用的水平(1.1×10~6CFU/ml)。hG-CSF逆转录病毒感染NIH3T3小鼠成纤维细胞后,分泌G-CSF达168U/ml,Southern分析表明hG-CSF基因已整合至NIH3T3-G-CSF细胞的基因组中,Northern和Western分析分别从mRNA和蛋白质水平证实了人G-CSF在NIH3T3-G-CSF细胞的表达。将NIH3T3-G-CSF细胞植入同系小鼠体内,能从血清中检测到持续表达的G-CSF活性。本研究为开展人G-CSF基因治疗奠定了基础。

R733.7

上海市科技启明星培养计划，国家自然科学基金，优秀中青年人才专项基金(39421009)资助