2006年第13卷第6期文章目次
2006, 13(6):401-403.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2006.6.001
摘要:
2006, 13(6):404-411.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2006.6.002
摘要:
2006, 13(6):412-416.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2006.6.003
摘要:
将抗人P185 erbB2 scFv-Fc-IL-2融合蛋白（HFI）作用于人卵巢癌细胞株SKOV3细胞和人外周血单个核细胞（PBMC），通过体外实验阐明HFI调变肿瘤细胞表面分子和激活免疫效应细胞的抗肿瘤机制，为HFI临床应用提供实验依据。方法：MTT法检测细胞增殖、杀伤活性；流式细胞术观察细胞表面分子的表达水平；生物活性法检测细胞膜相关TNF杀伤活性；RT-PCR检测细胞穿孔素表达水平。结果： HFI处理后，未观察到对SKOV3细胞增殖活性的直接抑制作用；SKOV3细胞表面杀伤相关分子ICAM-1、Fas表达率分别由24.85%、0.53%增高到85.36%、59.19%（P<0.01)；人PBMC的增殖活性增强，CD3 + CD8 + T细胞和CD3 --CD1 + CD56 + NK细胞分别由24.37%、6.90%提高到38.80%、13.45%（ P <0.01)；CD25、LFA-1、FasL表达水平分别由399%、86.52%、5.02%提高到12.96%、99.06% 16.19%（P<0.01)；穿孔素基因、膜相关TNF均表达增强，LAK样、NK样杀伤活性在各效靶比时均明显增高（P<0.01)。结论： HFI提高SKOV3细胞杀伤相关分子ICAM-1、Fas表达水平，并且对人PBMC有明显的增殖活化作用，通过激活LFA-1/ICAM-1、Fas/FasL途径提高杀伤介质穿孔素和膜相关TNF的释放，增强LAK样、NK样杀伤活性。
将抗人P185 erbB2 scFv-Fc-IL-2融合蛋白（HFI）作用于人卵巢癌细胞株SKOV3细胞和人外周血单个核细胞（PBMC），通过体外实验阐明HFI调变肿瘤细胞表面分子和激活免疫效应细胞的抗肿瘤机制，为HFI临床应用提供实验依据。方法：MTT法检测细胞增殖、杀伤活性；流式细胞术观察细胞表面分子的表达水平；生物活性法检测细胞膜相关TNF杀伤活性；RT-PCR检测细胞穿孔素表达水平。结果： HFI处理后，未观察到对SKOV3细胞增殖活性的直接抑制作用；SKOV3细胞表面杀伤相关分子ICAM-1、Fas表达率分别由24.85%、0.53%增高到85.36%、59.19%（P<0.01)；人PBMC的增殖活性增强，CD3 + CD8 + T细胞和CD3 --CD1 + CD56 + NK细胞分别由24.37%、6.90%提高到38.80%、13.45%（ P <0.01)；CD25、LFA-1、FasL表达水平分别由399%、86.52%、5.02%提高到12.96%、99.06% 16.19%（P<0.01)；穿孔素基因、膜相关TNF均表达增强，LAK样、NK样杀伤活性在各效靶比时均明显增高（P<0.01)。结论： HFI提高SKOV3细胞杀伤相关分子ICAM-1、Fas表达水平，并且对人PBMC有明显的增殖活化作用，通过激活LFA-1/ICAM-1、Fas/FasL途径提高杀伤介质穿孔素和膜相关TNF的释放，增强LAK样、NK样杀伤活性。
2006, 13(6):417-422.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2006.6.004
摘要:
应用噬菌体展示技术制备抗HGF受体Met特异性、高亲和力的全人抗体scFv片段。方法: 以从天然抗体库中筛选出的 Fab 基因可变区VH和VL为模板，分别在CDR区引入有限突变和随机突变，扩增出scFv基因库，克隆于pComb3XSS中，构建scFv次级突变抗体库，筛选高亲和力克隆。结果:经5轮细胞筛选和2轮抗原固相筛选，选取60个克隆进行ELISA检测，选择较高亲和力的噬菌体抗体，克隆于原核表达载体pBAD-gIII/A中，经诱导表达、SDS-PAGE和Western blotting分析，在相对分子质量30 000处出现预期大小的蛋白条带。单链抗体经表达、变性与复性和IMAC亲和纯化后，用于流式细胞术、免疫沉淀分析，结果表明，scFv能够与S114细胞表达Met的胞外区特异性结合，其亲和常数Kd 值为4.76×10 -8 mol/L，与突变前抗体的亲和力（ Kd值为5.24×10 -6 mol/L）相比，抗体的亲和力提高约100倍。竞争ELISA结果显示，亲和力成熟后抗体的抗原结合表位未变。 结论: 经过CDR突变和抗体库筛选，有效提高了抗体的亲和力，该抗体有望成为临床肿瘤诊断或治疗的候选分子。
应用噬菌体展示技术制备抗HGF受体Met特异性、高亲和力的全人抗体scFv片段。方法: 以从天然抗体库中筛选出的 Fab 基因可变区VH和VL为模板，分别在CDR区引入有限突变和随机突变，扩增出scFv基因库，克隆于pComb3XSS中，构建scFv次级突变抗体库，筛选高亲和力克隆。结果:经5轮细胞筛选和2轮抗原固相筛选，选取60个克隆进行ELISA检测，选择较高亲和力的噬菌体抗体，克隆于原核表达载体pBAD-gIII/A中，经诱导表达、SDS-PAGE和Western blotting分析，在相对分子质量30 000处出现预期大小的蛋白条带。单链抗体经表达、变性与复性和IMAC亲和纯化后，用于流式细胞术、免疫沉淀分析，结果表明，scFv能够与S114细胞表达Met的胞外区特异性结合，其亲和常数Kd 值为4.76×10 -8 mol/L，与突变前抗体的亲和力（ Kd值为5.24×10 -6 mol/L）相比，抗体的亲和力提高约100倍。竞争ELISA结果显示，亲和力成熟后抗体的抗原结合表位未变。 结论: 经过CDR突变和抗体库筛选，有效提高了抗体的亲和力，该抗体有望成为临床肿瘤诊断或治疗的候选分子。
2006, 13(6):423-428.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2006.6.005
摘要:
在毕赤酵母中表达血管基膜衍生多功能肽（vascular basement membrane-derived mulifunctional peptide,VBMDMP）,并鉴定其生物学活性。方法：利用PCR技术获得融合了谷胱甘肽转移酶(GST)的肿瘤抑素(tumstatin)活性成分的GST-VBMDMP基因，克隆到pPIC9K载体；然后原生质体转化法转化毕赤酵母细胞，行多克隆筛选和表型鉴定。获得His+Muts表型的转化子，在MGY培养液中30 ℃摇床培养，每24 h从培养液中转移1 ml培养液上清于-70 ℃保存，并保持培养瓶中培养液的量和培养液中甲醇0.5%的浓度不变，第9天行SDS-PAGE检测表达的蛋白并纯化,然后进行细胞和动物生物活性检测。结果： SDS-PAGE发现阳性重组子在MGY培养液中表达的蛋白量在1~7 d逐渐增加,到第8天后开始减少,用Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化获得GST-VBMDMP融合蛋白; GST VBMDMP能抑制C57BL／6鼠动脉内皮细胞管状结构的形成；同时GST VBMDMP（ 2 、6 、10 mg/kg）对小鼠Lewis肺癌原发瘤（瘤重抑制率分别为96.6%、82.1%、61.2%）和自发性肺转移瘤（瘤结节抑制率分别为96.8 %、87.9%、75.3%）均具有明显的抑制作用（P<0.01）。结论：VBMDMP能够抑制鼠动脉内皮细胞管状结构的形成，并对小鼠Lewis肺癌原发瘤和肺转移具有明显的抑制作用。
在毕赤酵母中表达血管基膜衍生多功能肽（vascular basement membrane-derived mulifunctional peptide,VBMDMP）,并鉴定其生物学活性。方法：利用PCR技术获得融合了谷胱甘肽转移酶(GST)的肿瘤抑素(tumstatin)活性成分的GST-VBMDMP基因，克隆到pPIC9K载体；然后原生质体转化法转化毕赤酵母细胞，行多克隆筛选和表型鉴定。获得His+Muts表型的转化子，在MGY培养液中30 ℃摇床培养，每24 h从培养液中转移1 ml培养液上清于-70 ℃保存，并保持培养瓶中培养液的量和培养液中甲醇0.5%的浓度不变，第9天行SDS-PAGE检测表达的蛋白并纯化,然后进行细胞和动物生物活性检测。结果： SDS-PAGE发现阳性重组子在MGY培养液中表达的蛋白量在1~7 d逐渐增加,到第8天后开始减少,用Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化获得GST-VBMDMP融合蛋白; GST VBMDMP能抑制C57BL／6鼠动脉内皮细胞管状结构的形成；同时GST VBMDMP（ 2 、6 、10 mg/kg）对小鼠Lewis肺癌原发瘤（瘤重抑制率分别为96.6%、82.1%、61.2%）和自发性肺转移瘤（瘤结节抑制率分别为96.8 %、87.9%、75.3%）均具有明显的抑制作用（P<0.01）。结论：VBMDMP能够抑制鼠动脉内皮细胞管状结构的形成，并对小鼠Lewis肺癌原发瘤和肺转移具有明显的抑制作用。
2006, 13(6):429-434.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2006.6.006
摘要:
通过体外、体内实验探讨肿瘤细胞柯萨奇腺病毒受体(coxsackie adenovirus receptor, CAR)表达水平与腺病毒转导效率的关系，为腺病毒相关的生物制剂在临床个体化应用提供实验依据。方法：将载有绿色荧光蛋白的Ad5 型腺病毒(Ad-GFP) 以100 MOI、200 MOI分别感染人食管癌细胞系KYSE510、KYSE150、EC9706、人宫颈癌细胞系HeLa、人卵巢癌细胞系SKOV3、人肝癌细胞系HepG2和人肺癌细胞系A549，感染后48 h通过流式细胞术检测Ad-GFP对不同细胞系的转导效率。采用Western blotting方法检测这些细胞中CAR的表达水平。将HeLa、A549、SKOV3、EC9706细胞分别接种于裸鼠腋下，接种细胞数分别为3×10 6 、3×10 6 、3×10 6 、2×10 6 ，建立裸鼠移植瘤模型。待肿瘤长径达5～7 mm时，在裸鼠移植瘤内注射Ad-GFP，每次1×10 9 PFU，间隔48 h注射第2次。第2次注射后48 h处死裸鼠，剖取瘤组织，荧光显微镜观察冰冻切片中GFP的表达情况以判定腺病毒在瘤体内的转导效率，同时用免疫组化法检测瘤组织内的CAR表达水平。结果： 200 MOI Ad-GFP感染A549、HeLa、HepG2、KYSE150细胞48 h后分别有92.67%、89.31%、84.98%、74.59%的细胞表达GFP；而SKOV3、KYSE510、EC9706细胞中腺病毒的转导效率明显降低，GFP阳性率分别为30.06%、27.40%、18.93%；各种细胞的CAR蛋白表达水平与腺病毒的转导效率呈正相关。注射Ad-GFP的裸鼠移植瘤组织中可见HeLa、A549瘤组织内有明显的点状绿色荧光，而SKOV3、EC9706瘤组织内表达GFP的细胞数明显少于前两种瘤组织；HeLa、A549裸鼠移植瘤组织内大多数瘤细胞高表达CAR ()，SKOV3、EC9706移植瘤组织内CAR表达水平较低(+或-),表明瘤体内CAR表达水平与Ad GFP的转导效率也呈正相关。结论： 体内外实验均显示肿瘤细胞的CAR表达水平与5型腺病毒转导效率密切相关。肿瘤患者治疗前检测组织中CAR表达水平有助于规范腺病毒载体的基因治疗药物的个体化使用。
通过体外、体内实验探讨肿瘤细胞柯萨奇腺病毒受体(coxsackie adenovirus receptor, CAR)表达水平与腺病毒转导效率的关系，为腺病毒相关的生物制剂在临床个体化应用提供实验依据。方法：将载有绿色荧光蛋白的Ad5 型腺病毒(Ad-GFP) 以100 MOI、200 MOI分别感染人食管癌细胞系KYSE510、KYSE150、EC9706、人宫颈癌细胞系HeLa、人卵巢癌细胞系SKOV3、人肝癌细胞系HepG2和人肺癌细胞系A549，感染后48 h通过流式细胞术检测Ad-GFP对不同细胞系的转导效率。采用Western blotting方法检测这些细胞中CAR的表达水平。将HeLa、A549、SKOV3、EC9706细胞分别接种于裸鼠腋下，接种细胞数分别为3×10 6 、3×10 6 、3×10 6 、2×10 6 ，建立裸鼠移植瘤模型。待肿瘤长径达5～7 mm时，在裸鼠移植瘤内注射Ad-GFP，每次1×10 9 PFU，间隔48 h注射第2次。第2次注射后48 h处死裸鼠，剖取瘤组织，荧光显微镜观察冰冻切片中GFP的表达情况以判定腺病毒在瘤体内的转导效率，同时用免疫组化法检测瘤组织内的CAR表达水平。结果： 200 MOI Ad-GFP感染A549、HeLa、HepG2、KYSE150细胞48 h后分别有92.67%、89.31%、84.98%、74.59%的细胞表达GFP；而SKOV3、KYSE510、EC9706细胞中腺病毒的转导效率明显降低，GFP阳性率分别为30.06%、27.40%、18.93%；各种细胞的CAR蛋白表达水平与腺病毒的转导效率呈正相关。注射Ad-GFP的裸鼠移植瘤组织中可见HeLa、A549瘤组织内有明显的点状绿色荧光，而SKOV3、EC9706瘤组织内表达GFP的细胞数明显少于前两种瘤组织；HeLa、A549裸鼠移植瘤组织内大多数瘤细胞高表达CAR ()，SKOV3、EC9706移植瘤组织内CAR表达水平较低(+或-),表明瘤体内CAR表达水平与Ad GFP的转导效率也呈正相关。结论： 体内外实验均显示肿瘤细胞的CAR表达水平与5型腺病毒转导效率密切相关。肿瘤患者治疗前检测组织中CAR表达水平有助于规范腺病毒载体的基因治疗药物的个体化使用。
2006, 13(6):435-441.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2006.6.007
摘要:
构建表达突变减毒的志贺样毒素Ⅰ(Shiga-like toxin 1, Stx1) 的真核表达载体，并考察其抗人卵巢癌细胞SKOV3的活性。方法： 重叠PCR法构建毒性为原毒素毒性1/10和1/100的突变减毒Stx1编码序列，T A克隆并测序后分别连入真核表达载体pcDNA3.1。转染SKOV3细胞，RT-PCR法检测Stx1 mRNA在SKOV3细胞中的表达，观察突变减毒Stx1对SKOV3细胞周期的影响和致SKOV3细胞死亡的方式。使用SKOV3荷瘤裸鼠模型，不同毒性突变减毒Stx1真核表达载体经脂质体包裹后肿瘤局部注射给药，评价其体内抑瘤能力。结果: 突变减毒Stx1真核表达载体经酶切和测序鉴定与预期突变序列一致；RT-PCR证实转染后的SKOV3细胞中存在目的mRNA；体外实验观察到该载体转染可以使人卵巢癌SKOV3细胞的细胞周期阻滞于G 2 /M期，转染后SKOV3细胞死亡的主要途径是坏死；体内实验显示突变减毒Stx1真核表达载体可以抑制裸鼠体内SKOV3移植瘤的生长。结论: 通过重叠PCR方法获得2种突变减毒Stx1编码序列，成功构建了相应的真核表达载体，并证实该载体具有明显的抗卵巢癌活性。
构建表达突变减毒的志贺样毒素Ⅰ(Shiga-like toxin 1, Stx1) 的真核表达载体，并考察其抗人卵巢癌细胞SKOV3的活性。方法： 重叠PCR法构建毒性为原毒素毒性1/10和1/100的突变减毒Stx1编码序列，T A克隆并测序后分别连入真核表达载体pcDNA3.1。转染SKOV3细胞，RT-PCR法检测Stx1 mRNA在SKOV3细胞中的表达，观察突变减毒Stx1对SKOV3细胞周期的影响和致SKOV3细胞死亡的方式。使用SKOV3荷瘤裸鼠模型，不同毒性突变减毒Stx1真核表达载体经脂质体包裹后肿瘤局部注射给药，评价其体内抑瘤能力。结果: 突变减毒Stx1真核表达载体经酶切和测序鉴定与预期突变序列一致；RT-PCR证实转染后的SKOV3细胞中存在目的mRNA；体外实验观察到该载体转染可以使人卵巢癌SKOV3细胞的细胞周期阻滞于G 2 /M期，转染后SKOV3细胞死亡的主要途径是坏死；体内实验显示突变减毒Stx1真核表达载体可以抑制裸鼠体内SKOV3移植瘤的生长。结论: 通过重叠PCR方法获得2种突变减毒Stx1编码序列，成功构建了相应的真核表达载体，并证实该载体具有明显的抗卵巢癌活性。
2006, 13(6):442-446.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2006.6.008
摘要:
评价化疗药物紫杉醇联合应用肿瘤疫苗对小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤的治疗效果。方法：以编码有GM-CSF的腺病毒感染Lewis肺癌细胞3LL，制备肿瘤疫苗3LL/GM CSF。以2×104个3LL瘤细胞皮下注射C57BL/6（H-2-b）小鼠腹股沟部，制备小鼠皮下移植瘤。检测体内、外应用紫杉醇对Lewis肺癌细胞3LL的杀伤敏感性。在小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤体内首先以紫杉醇化疗，随后以肿瘤疫苗3LL/GM-CSF免疫；或反之，首先以肿瘤疫苗免疫，随后以紫杉醇化疗，观察肿瘤生长和小鼠生存状况，以及检测小鼠体内对肿瘤的特异性杀伤效率和免疫应答记忆反应。结果： 紫杉醇体外作用于3LL肿瘤细胞，24 h后在浓度为100 nmol/L时可使32.10 %的3LL肿瘤细胞发生死亡；但体内注射紫杉醇（5、10和25 mg/kg）不能使所有3LL荷瘤小鼠肿瘤消退。体内使用紫杉醇后应用3LL/GM-CSF肿瘤疫苗，70%的荷瘤小鼠发生显著的肿瘤消退，与单纯化疗的小鼠相比生存时间明显延长（70.0 vs 27.5 d）; 化疗后应用肿瘤疫苗诱导了体内对3LL的特异性杀伤，第3天体内杀伤率达41.35%;同时，存活小鼠能抵抗2×10 4 3LL肿瘤细胞的再次攻击。接种3LL/GM-CSF肿瘤疫苗后应用紫杉醇化疗却不能使肿瘤消退。结论：化疗后应用肿瘤疫苗免疫可诱导出抗原特异性免疫效应，使荷瘤小鼠肿瘤消退并延长生存时间，为临床开展化疗后的肿瘤疫苗主动免疫提供了实验依据。
评价化疗药物紫杉醇联合应用肿瘤疫苗对小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤的治疗效果。方法：以编码有GM-CSF的腺病毒感染Lewis肺癌细胞3LL，制备肿瘤疫苗3LL/GM CSF。以2×104个3LL瘤细胞皮下注射C57BL/6（H-2-b）小鼠腹股沟部，制备小鼠皮下移植瘤。检测体内、外应用紫杉醇对Lewis肺癌细胞3LL的杀伤敏感性。在小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤体内首先以紫杉醇化疗，随后以肿瘤疫苗3LL/GM-CSF免疫；或反之，首先以肿瘤疫苗免疫，随后以紫杉醇化疗，观察肿瘤生长和小鼠生存状况，以及检测小鼠体内对肿瘤的特异性杀伤效率和免疫应答记忆反应。结果： 紫杉醇体外作用于3LL肿瘤细胞，24 h后在浓度为100 nmol/L时可使32.10 %的3LL肿瘤细胞发生死亡；但体内注射紫杉醇（5、10和25 mg/kg）不能使所有3LL荷瘤小鼠肿瘤消退。体内使用紫杉醇后应用3LL/GM-CSF肿瘤疫苗，70%的荷瘤小鼠发生显著的肿瘤消退，与单纯化疗的小鼠相比生存时间明显延长（70.0 vs 27.5 d）; 化疗后应用肿瘤疫苗诱导了体内对3LL的特异性杀伤，第3天体内杀伤率达41.35%;同时，存活小鼠能抵抗2×10 4 3LL肿瘤细胞的再次攻击。接种3LL/GM-CSF肿瘤疫苗后应用紫杉醇化疗却不能使肿瘤消退。结论：化疗后应用肿瘤疫苗免疫可诱导出抗原特异性免疫效应，使荷瘤小鼠肿瘤消退并延长生存时间，为临床开展化疗后的肿瘤疫苗主动免疫提供了实验依据。
2006, 13(6):447-451.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2006.6.009
摘要:
研究蛋白激酶B(protien kinase B，PKB)、缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)在胃癌中的表达及其临床意义。方法： RT PCR法检测26例胃癌及癌旁组织中PKB1、PKB2、PKB3及HIF-1α mRNA表达，免疫组化检测64例胃癌及26例癌旁组织中磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated PKB, pPKB)蛋白和HIF-1α蛋白的表达。结果： 1）胃癌及相应癌旁正常组织中PKB1、2、3 mRNA的表达阳性率皆为100%，表达水平差异无显著性(P＞0.05)；胃癌组织中HIF-1α mRNA表达水平显著高于癌旁组织 (1.36±0.14 vs 0.54±0.18, P ＜0.05)。（2）胃癌组织中pPKB、HIF-1α蛋白表达阳性率显著高于癌旁组织(χ2分别为26.936、15.950,P＜0.05)。（3）胃癌组织中pPKB、HIF-1α蛋白表达率均与TNM分期、侵润深度、淋巴结转移、远处转移存在相关性( P ＜0.05)。结论： PKB表达异常发生于翻译或翻译后水平；PKB、HIF-1α过表达于胃癌组织，与胃癌细胞的增殖、凋亡和转移等密切相关。
研究蛋白激酶B(protien kinase B，PKB)、缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)在胃癌中的表达及其临床意义。方法： RT PCR法检测26例胃癌及癌旁组织中PKB1、PKB2、PKB3及HIF-1α mRNA表达，免疫组化检测64例胃癌及26例癌旁组织中磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated PKB, pPKB)蛋白和HIF-1α蛋白的表达。结果： 1）胃癌及相应癌旁正常组织中PKB1、2、3 mRNA的表达阳性率皆为100%，表达水平差异无显著性(P＞0.05)；胃癌组织中HIF-1α mRNA表达水平显著高于癌旁组织 (1.36±0.14 vs 0.54±0.18, P ＜0.05)。（2）胃癌组织中pPKB、HIF-1α蛋白表达阳性率显著高于癌旁组织(χ2分别为26.936、15.950,P＜0.05)。（3）胃癌组织中pPKB、HIF-1α蛋白表达率均与TNM分期、侵润深度、淋巴结转移、远处转移存在相关性( P ＜0.05)。结论： PKB表达异常发生于翻译或翻译后水平；PKB、HIF-1α过表达于胃癌组织，与胃癌细胞的增殖、凋亡和转移等密切相关。
2006, 13(6):452-456.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2006.6.010
摘要:
研究重组TFAR19(TF-1 cell apoptsis-related gene 19)蛋白对鼻咽癌细胞株CNE-1端粒酶活性及端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA表达的影响，探讨重组TFAR19蛋白促CNE-1细胞凋亡的作用机制。方法：将不同浓度的高纯度重组TFAR19蛋白分别和人类鼻咽癌细胞株CNE-1共同培养后，通过7-AAD及Annexin V-PE标记进行流式细胞术分析，检测TFAR19蛋白对细胞的促凋亡效应；RT-PCR法比较试验组和对照组CNE-1细胞株端粒酶hTERT mRNA的表达水平；TRAP-银染法检测重组TFAR19蛋白作用下CNE-1细胞株端粒酶活性的改变。结果：(1) 一定浓度的TFAR19蛋白在未加载体的情况下，可促进细胞凋亡，加入 5、10、15、20、30 mg/L的TFAR19蛋白后, CNE-1细胞的凋亡率分别是:15.26％，29.48％，3711％，5420％，72.36％。阳性对照组（凋亡诱导剂stuanrosporin 处理）与阴性对照组（PBS处理）的细胞凋亡率分别是9837％、1340％。(2) 试验组与对照组CNE-1细胞株端粒酶hTERT mRNA表达无显著差异。(3) 与20 mg/L以上浓度的重组TFAR19蛋白共同培养后，CNE-1细胞株端粒酶活性明显降低。结论：重组TFAR19蛋白在较高浓度下可降低鼻咽癌细胞株CNE-1的端粒酶活性，明显促进肿瘤细胞凋亡。
研究重组TFAR19(TF-1 cell apoptsis-related gene 19)蛋白对鼻咽癌细胞株CNE-1端粒酶活性及端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA表达的影响，探讨重组TFAR19蛋白促CNE-1细胞凋亡的作用机制。方法：将不同浓度的高纯度重组TFAR19蛋白分别和人类鼻咽癌细胞株CNE-1共同培养后，通过7-AAD及Annexin V-PE标记进行流式细胞术分析，检测TFAR19蛋白对细胞的促凋亡效应；RT-PCR法比较试验组和对照组CNE-1细胞株端粒酶hTERT mRNA的表达水平；TRAP-银染法检测重组TFAR19蛋白作用下CNE-1细胞株端粒酶活性的改变。结果：(1) 一定浓度的TFAR19蛋白在未加载体的情况下，可促进细胞凋亡，加入 5、10、15、20、30 mg/L的TFAR19蛋白后, CNE-1细胞的凋亡率分别是:15.26％，29.48％，3711％，5420％，72.36％。阳性对照组（凋亡诱导剂stuanrosporin 处理）与阴性对照组（PBS处理）的细胞凋亡率分别是9837％、1340％。(2) 试验组与对照组CNE-1细胞株端粒酶hTERT mRNA表达无显著差异。(3) 与20 mg/L以上浓度的重组TFAR19蛋白共同培养后，CNE-1细胞株端粒酶活性明显降低。结论：重组TFAR19蛋白在较高浓度下可降低鼻咽癌细胞株CNE-1的端粒酶活性，明显促进肿瘤细胞凋亡。
2006, 13(6):457-461.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2006.6.011
摘要:
目的观察端粒酶反义寡核苷酸、As2O3对肝癌细胞生长的影响,寻找低剂量、低毒、高效、安全的抗肝癌新疗法。方法自行设计合成靶向端粒酶模板区的20nt硫代反义寡核苷酸,观察端粒酶反义寡核苷酸与As2O3对肝癌细胞端粒酶活性的影响及两者协同对肝癌细胞生长的影响,采用H-E染色、流式细胞仪及DNA琼脂糖凝胶电泳观察端粒酶反义寡核苷酸与As2O3对肝癌细胞的凋亡诱导作用,以流式细胞术检测肝癌细胞的Fas、Fas-L、bcl-2蛋白的表达。结果5μmol/L的端粒酶反义寡核苷酸作用24h可显著抑制肝癌细胞端粒酶活性(P<0.01);肝癌细胞端粒酶活性被抑制后对As2O3诱导凋亡的敏感性显著增加,表现为低浓度、短时间即可诱导肝癌细胞凋亡(P<0.01),端粒酶反义寡核苷酸与As2O3对肝癌细胞的凋亡诱导作用是通过Fas、Fas-L途径实现的。结论抑制肝癌细胞端粒酶活性可显著增强其对As2O3诱导凋亡的敏感性,减少砷剂用量,两者协同有潜在的临床应用前景。
目的观察端粒酶反义寡核苷酸、As2O3对肝癌细胞生长的影响,寻找低剂量、低毒、高效、安全的抗肝癌新疗法。方法自行设计合成靶向端粒酶模板区的20nt硫代反义寡核苷酸,观察端粒酶反义寡核苷酸与As2O3对肝癌细胞端粒酶活性的影响及两者协同对肝癌细胞生长的影响,采用H-E染色、流式细胞仪及DNA琼脂糖凝胶电泳观察端粒酶反义寡核苷酸与As2O3对肝癌细胞的凋亡诱导作用,以流式细胞术检测肝癌细胞的Fas、Fas-L、bcl-2蛋白的表达。结果5μmol/L的端粒酶反义寡核苷酸作用24h可显著抑制肝癌细胞端粒酶活性(P<0.01);肝癌细胞端粒酶活性被抑制后对As2O3诱导凋亡的敏感性显著增加,表现为低浓度、短时间即可诱导肝癌细胞凋亡(P<0.01),端粒酶反义寡核苷酸与As2O3对肝癌细胞的凋亡诱导作用是通过Fas、Fas-L途径实现的。结论抑制肝癌细胞端粒酶活性可显著增强其对As2O3诱导凋亡的敏感性,减少砷剂用量,两者协同有潜在的临床应用前景。
2006, 13(6):462-468.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2006.6.012
摘要:
目的：构建死亡受体5（death receptor 5，DR5）胞外区域（eDR5）的表达载体，表达纯化重组蛋白并鉴定其生物特性。方法：通过重叠 PCR 获得 DR5 胞外段编码序列，构建 pET-22b(+)/DR5 表达载体，转化大肠杆菌 BL21（DE3），IPTG 诱导表达，Ni 2+柱亲和纯化，SDS PAGE、直接 ELISA 鉴定纯化产物的纯度和特异性，用 MTT 法检测eDR5 蛋白阻断DR5 单克隆抗体 FMU1.5 和 TRAIL 诱导人胶质瘤细胞株 U343(高表达DR5）、U373（低表达DR5 ）细胞凋亡的作用。结果：获得了 DR5 胞外段编码序列，目的蛋白在上清及包涵体中都有表达, 表达量占菌体总蛋白的 30% 以上，纯化的重组蛋白纯度达 95% 以上，蛋白产量达 9 mg/ml。ELISA 结果表明所纯化蛋白为eDR5。eDR5 蛋白可部分阻断 FMU1.5 和 TRAIL 诱导人胶质瘤细胞株 U343 细胞凋亡的作用，其阻断率与 DR5 表达相关。结论：死亡受体 5 胞外段基因的成功重组、表达及纯化，为进一步的功能研究奠定了基础。
目的：构建死亡受体5（death receptor 5，DR5）胞外区域（eDR5）的表达载体，表达纯化重组蛋白并鉴定其生物特性。方法：通过重叠 PCR 获得 DR5 胞外段编码序列，构建 pET-22b(+)/DR5 表达载体，转化大肠杆菌 BL21（DE3），IPTG 诱导表达，Ni 2+柱亲和纯化，SDS PAGE、直接 ELISA 鉴定纯化产物的纯度和特异性，用 MTT 法检测eDR5 蛋白阻断DR5 单克隆抗体 FMU1.5 和 TRAIL 诱导人胶质瘤细胞株 U343(高表达DR5）、U373（低表达DR5 ）细胞凋亡的作用。结果：获得了 DR5 胞外段编码序列，目的蛋白在上清及包涵体中都有表达, 表达量占菌体总蛋白的 30% 以上，纯化的重组蛋白纯度达 95% 以上，蛋白产量达 9 mg/ml。ELISA 结果表明所纯化蛋白为eDR5。eDR5 蛋白可部分阻断 FMU1.5 和 TRAIL 诱导人胶质瘤细胞株 U343 细胞凋亡的作用，其阻断率与 DR5 表达相关。结论：死亡受体 5 胞外段基因的成功重组、表达及纯化，为进一步的功能研究奠定了基础。
2006, 13(6):466-468.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2006.6.013
摘要:
目的： 探讨p53腺病毒（简称Ad-p53）注射液联合中药得力生及消癌平治疗小鼠腹水瘤的协同作用。 方法： 建立昆明小鼠H22肝癌腹水瘤模型，建模48 h后分组分别给予Ad-p53、中药得力生和消癌平或两药联用。用药1周后检测体重、腹围、腹水量、腹水瘤细胞计数，流式细胞仪测定瘤细胞凋亡百分率以及细胞周期情况。 结果： Ad-p53、得力生、消癌平单药治疗组，除体重以外的上述指标与对照组比较均有统计学差异（ P ＜0.05），Ad-p53+得力生和Ad-p53＋消癌平组的腹围增长率、腹水量、瘤细胞计数、晚期细胞凋亡率均明显少于各单药治疗组（ P ＜0.05）。 结论： 腹腔注射Ad-p53、得力生和消癌平均可抑制H22细胞生长并减少腹水形成，Ad-p53与中药得力生、消癌平联合腹腔内给药对治疗腹水瘤有协同作用。
目的： 探讨p53腺病毒（简称Ad-p53）注射液联合中药得力生及消癌平治疗小鼠腹水瘤的协同作用。 方法： 建立昆明小鼠H22肝癌腹水瘤模型，建模48 h后分组分别给予Ad-p53、中药得力生和消癌平或两药联用。用药1周后检测体重、腹围、腹水量、腹水瘤细胞计数，流式细胞仪测定瘤细胞凋亡百分率以及细胞周期情况。 结果： Ad-p53、得力生、消癌平单药治疗组，除体重以外的上述指标与对照组比较均有统计学差异（ P ＜0.05），Ad-p53+得力生和Ad-p53＋消癌平组的腹围增长率、腹水量、瘤细胞计数、晚期细胞凋亡率均明显少于各单药治疗组（ P ＜0.05）。 结论： 腹腔注射Ad-p53、得力生和消癌平均可抑制H22细胞生长并减少腹水形成，Ad-p53与中药得力生、消癌平联合腹腔内给药对治疗腹水瘤有协同作用。
2006, 13(6):469-474.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2006.6.014
摘要:
目的：探讨人非小细胞肺癌细胞A549中孕酮对生长抑素受体（somatostatin recepter，SSTR）表达的调节。方法：免疫组化法测定A549细胞孕激素受体的表达, RT-PCR检测孕酮作用前后SSTR亚型mRNA的表达。结果： A549细胞表达孕激素受体,同时表达生长抑素受体亚型SSTR2、SSTR1、SSTR4和SSTR5 mRNA，不表达SSTR3 mRNA。不同浓度的孕酮作用A549细胞24 h后，SSTR各亚型mRNA表达普遍上调（P<0.05）；10 nmol/L组及1 000 nmol/L组细胞出现了SSTR3 mRNA的表达。延长10 nmol/L孕酮作用时间至48 h， SSTR3与SSTR5 mRNA表达继续上调（P<0.05）。结论：孕酮上调A549细胞SSTR各亚型mRNA的表达，尤其是SSTR3与SSTR5 mRNA；调节作用与孕酮的作用时间和浓度有关。
目的：探讨人非小细胞肺癌细胞A549中孕酮对生长抑素受体（somatostatin recepter，SSTR）表达的调节。方法：免疫组化法测定A549细胞孕激素受体的表达, RT-PCR检测孕酮作用前后SSTR亚型mRNA的表达。结果： A549细胞表达孕激素受体,同时表达生长抑素受体亚型SSTR2、SSTR1、SSTR4和SSTR5 mRNA，不表达SSTR3 mRNA。不同浓度的孕酮作用A549细胞24 h后，SSTR各亚型mRNA表达普遍上调（P<0.05）；10 nmol/L组及1 000 nmol/L组细胞出现了SSTR3 mRNA的表达。延长10 nmol/L孕酮作用时间至48 h， SSTR3与SSTR5 mRNA表达继续上调（P<0.05）。结论：孕酮上调A549细胞SSTR各亚型mRNA的表达，尤其是SSTR3与SSTR5 mRNA；调节作用与孕酮的作用时间和浓度有关。
2006, 13(6):471-474.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2006.6.015
摘要:
人35型（Ad35）和11型（Ad11）腺病毒同属于B 2 亚群，病毒受体均为CD46分子，Ad35和Ad11的中和抗体在不同地区不同人种的阳性率都比较低，且对肿瘤细胞、造血干细胞、树突状细胞等一些传统的5型和2型腺病毒嗜性较低的细胞有较高的感染效率，而且转移基因的表达水平较高，提示Ad11和Ad35是一类具有良好开发潜力的肿瘤基因治疗载体。目前，开发利用Ad35或Ad11主要有三种形式：嵌合型腺病毒载体、复制缺陷的35型或11型腺病毒载体和嵌合型的35型或11型“gutless”腺病毒载体。这些载体的体外疗效较好，但体内疗效不理想，原因主要是病毒颗粒在从注射部位到达靶组织会被多重屏障所拦截。因此，深入研究Ad35和Ad11感染细胞的过程和机制， 有助于将它们应用于包括肿瘤在内多种重大疾病的基因治疗。
人35型（Ad35）和11型（Ad11）腺病毒同属于B 2 亚群，病毒受体均为CD46分子，Ad35和Ad11的中和抗体在不同地区不同人种的阳性率都比较低，且对肿瘤细胞、造血干细胞、树突状细胞等一些传统的5型和2型腺病毒嗜性较低的细胞有较高的感染效率，而且转移基因的表达水平较高，提示Ad11和Ad35是一类具有良好开发潜力的肿瘤基因治疗载体。目前，开发利用Ad35或Ad11主要有三种形式：嵌合型腺病毒载体、复制缺陷的35型或11型腺病毒载体和嵌合型的35型或11型“gutless”腺病毒载体。这些载体的体外疗效较好，但体内疗效不理想，原因主要是病毒颗粒在从注射部位到达靶组织会被多重屏障所拦截。因此，深入研究Ad35和Ad11感染细胞的过程和机制， 有助于将它们应用于包括肿瘤在内多种重大疾病的基因治疗。
2006, 13(6):475-480.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2006.6.016
摘要:
NK细胞识别靶细胞时在接触表面形成大量的超分子集落，结构上与神经突触相似，称为NK细胞免疫突触。NK细胞抑制性受体和活化性受体分别与相应的配体结合形成抑制性免疫突触与活化性免疫突触。免疫突触的成熟是一个伴随着大量分子重新组合和隔离分布的动态过程。很多因素可以影响它的形成，其中肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素C等可以明显抑制早期抑制性突触的形成，活化性突触中脂筏向细胞间接触位点极化能够为大量活化性信号提供一个锚定平台。免疫突触可以促进细胞间的接触、提供细胞间信号传递的平台、参与活化检查节点的形成。进一步对其结构、形成过程、信号整合等进行探讨将为提高NK细胞抗肿瘤和抗病毒治疗效果提供新的策略。
NK细胞识别靶细胞时在接触表面形成大量的超分子集落，结构上与神经突触相似，称为NK细胞免疫突触。NK细胞抑制性受体和活化性受体分别与相应的配体结合形成抑制性免疫突触与活化性免疫突触。免疫突触的成熟是一个伴随着大量分子重新组合和隔离分布的动态过程。很多因素可以影响它的形成，其中肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素C等可以明显抑制早期抑制性突触的形成，活化性突触中脂筏向细胞间接触位点极化能够为大量活化性信号提供一个锚定平台。免疫突触可以促进细胞间的接触、提供细胞间信号传递的平台、参与活化检查节点的形成。进一步对其结构、形成过程、信号整合等进行探讨将为提高NK细胞抗肿瘤和抗病毒治疗效果提供新的策略。
2006, 13(6):478-480.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2006.6.017
摘要:
骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种磷酸化酸性糖蛋白分子，人体的破骨细胞、巨噬细胞、T细胞、以及血管平滑肌细胞等均可分泌OPN，其基因定位于染色体4q13。OPN具有细胞黏连蛋白的功能，可以与CD44、整合素α v β 3 以及αvβ5结合，OPN还参与骨质重建、新血管生成和炎症反应；OPN在肿瘤转移中起协同作用。在卵巢癌的早期诊断和预后监测方面可作为CA125以及其他细胞因子等标志物的补充。检测方法可望更简便。在基因转录水平上抑制OPN及其主要受体可能成为治疗肿瘤的新药物靶点。
骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种磷酸化酸性糖蛋白分子，人体的破骨细胞、巨噬细胞、T细胞、以及血管平滑肌细胞等均可分泌OPN，其基因定位于染色体4q13。OPN具有细胞黏连蛋白的功能，可以与CD44、整合素α v β 3 以及αvβ5结合，OPN还参与骨质重建、新血管生成和炎症反应；OPN在肿瘤转移中起协同作用。在卵巢癌的早期诊断和预后监测方面可作为CA125以及其他细胞因子等标志物的补充。检测方法可望更简便。在基因转录水平上抑制OPN及其主要受体可能成为治疗肿瘤的新药物靶点。
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- 《中国肿瘤生物治疗杂志》
- 1994年创刊
- 主办单位：中国免疫学会、中国抗癌学会
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