2016年第23卷第2期文章目次
2016, 23(2):149-160.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.001
摘要:
肿瘤免疫细胞治疗近年来因其疗效显著而备受瞩目。免疫细胞，包括T细胞、NK细胞和DC在抗肿瘤免疫应答以及肿瘤免疫治疗中发挥了重要作用。其中，嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）修饰T细胞（CAR-T）技术和逆转肿瘤免疫抑制功能的CTLA-4和PD-1/PD-L1等免疫检查点抑制剂疗法分别在血液肿瘤及黑素瘤等实体肿瘤治疗中取得了令人振奋的效果，如何进一步提高疗效、增加适应性肿瘤病种并控制其免疫相关的不良反应成为日后研究重点；NK 细胞也将利用CAR技术和免疫检查点抑制剂进一步增强其在肿瘤治疗中的作用；DC作为第一个被FDA批准的治疗性肿瘤疫苗，在证明其安全无毒副作用的基础上，如何提高疗效成为关注热点。本文结合近年来肿瘤免疫细胞治疗的进展及该领域中亟需解决的问题作一分析与展望。
肿瘤免疫细胞治疗近年来因其疗效显著而备受瞩目。免疫细胞，包括T细胞、NK细胞和DC在抗肿瘤免疫应答以及肿瘤免疫治疗中发挥了重要作用。其中，嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）修饰T细胞（CAR-T）技术和逆转肿瘤免疫抑制功能的CTLA-4和PD-1/PD-L1等免疫检查点抑制剂疗法分别在血液肿瘤及黑素瘤等实体肿瘤治疗中取得了令人振奋的效果，如何进一步提高疗效、增加适应性肿瘤病种并控制其免疫相关的不良反应成为日后研究重点；NK 细胞也将利用CAR技术和免疫检查点抑制剂进一步增强其在肿瘤治疗中的作用；DC作为第一个被FDA批准的治疗性肿瘤疫苗，在证明其安全无毒副作用的基础上，如何提高疗效成为关注热点。本文结合近年来肿瘤免疫细胞治疗的进展及该领域中亟需解决的问题作一分析与展望。
2016, 23(2):161-167.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.002
摘要:
目的：构建链霉亲和素（streptavidin, SA）与Beclin1进化保守区（evolutionary conserved district，ECD）融合蛋白原核表达载体，将融合蛋白与生物素-前列腺特异性膜抗原（prostate specific membrane antigen，PSMA）特异性适配子A10偶联制备PSMA靶向系统，鉴定其促进PSMA+前列腺癌细胞凋亡及自噬的功能。方法：采用基因合成技术获得融合基因SA-ECD，克隆至PUC57载体鉴定无误后，再将其定向插入原核表达载体PET30a，IPTG诱导融合蛋白表达，镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白，Western blotting鉴定。按照生物素-A10∶SA-ECD摩尔比为4∶1的比例制备PSMA特异性的偶联物即靶向系统，凝胶迁移阻滞实验（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）验证SA-ECD与生物素的结合，流式细胞术、Western blotting、锥虫蓝染色分别检测靶向系统对前列腺癌细胞凋亡、自噬相关蛋白表达和细胞活力的影响。结果：双酶切及基因测序证实重组质粒PET30a-SA-ECD构建成功，IPTG诱导SA-ECD融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达并经亲和凝胶层析成功纯化。EMSA实验证明SA-ECD能有效结合生物素-A10。靶向系统可促进PSMA+前列腺癌细胞凋亡和自噬，同时抑制癌细胞活力。结论：成功表达并纯化融合蛋白SA-ECD，构建的生物素-A10∶SA-ECD靶向系统能够杀伤PSMA+前列腺癌细胞。
目的：构建链霉亲和素（streptavidin, SA）与Beclin1进化保守区（evolutionary conserved district，ECD）融合蛋白原核表达载体，将融合蛋白与生物素-前列腺特异性膜抗原（prostate specific membrane antigen，PSMA）特异性适配子A10偶联制备PSMA靶向系统，鉴定其促进PSMA+前列腺癌细胞凋亡及自噬的功能。方法：采用基因合成技术获得融合基因SA-ECD，克隆至PUC57载体鉴定无误后，再将其定向插入原核表达载体PET30a，IPTG诱导融合蛋白表达，镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白，Western blotting鉴定。按照生物素-A10∶SA-ECD摩尔比为4∶1的比例制备PSMA特异性的偶联物即靶向系统，凝胶迁移阻滞实验（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）验证SA-ECD与生物素的结合，流式细胞术、Western blotting、锥虫蓝染色分别检测靶向系统对前列腺癌细胞凋亡、自噬相关蛋白表达和细胞活力的影响。结果：双酶切及基因测序证实重组质粒PET30a-SA-ECD构建成功，IPTG诱导SA-ECD融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达并经亲和凝胶层析成功纯化。EMSA实验证明SA-ECD能有效结合生物素-A10。靶向系统可促进PSMA+前列腺癌细胞凋亡和自噬，同时抑制癌细胞活力。结论：成功表达并纯化融合蛋白SA-ECD，构建的生物素-A10∶SA-ECD靶向系统能够杀伤PSMA+前列腺癌细胞。
2016, 23(2):168-174.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.003
摘要:
目的：检测Twist-1基因在白血病患者和造血系统恶性肿瘤细胞系中的表达情况，并探讨其高表达对髓系白血病细胞增殖和凋亡的影响。方法：用Real-time PCR检测急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）、急性淋巴细胞白血病（acute lymphoid leukemia, ALL）、慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia, CML）患者和正常人的骨髓单个核细胞对照以及造血系统恶性肿瘤细胞系中Twist-1 mRNA表达情况。构建Twist-1过表达及干扰载体，制备慢病毒并感染髓系白血病细胞系K562、U937、KG-1a，通过细胞计数实验、集落形成实验、流式细胞术、Annexin V/PI方法评价Twist-1对白血病细胞增殖、集落形成能力、周期、凋亡的影响。结果：Twist-1在AML及CML患者中的表达水平显著高于对照（均P<0.05），而ALL患者与对照组没有显著差异（P＞0.05）。在K562、U937、KG-1a中过表达及干扰实验证实，Twist-1高表达促进肿瘤细胞增殖、集落形成并抑制细胞凋亡；干扰Twist-1表达则效果相反。结论：Twist-1高表达于AML、CML髓系白血病细胞，并促进白血病细胞的增殖和抑制凋亡。
目的：检测Twist-1基因在白血病患者和造血系统恶性肿瘤细胞系中的表达情况，并探讨其高表达对髓系白血病细胞增殖和凋亡的影响。方法：用Real-time PCR检测急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）、急性淋巴细胞白血病（acute lymphoid leukemia, ALL）、慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia, CML）患者和正常人的骨髓单个核细胞对照以及造血系统恶性肿瘤细胞系中Twist-1 mRNA表达情况。构建Twist-1过表达及干扰载体，制备慢病毒并感染髓系白血病细胞系K562、U937、KG-1a，通过细胞计数实验、集落形成实验、流式细胞术、Annexin V/PI方法评价Twist-1对白血病细胞增殖、集落形成能力、周期、凋亡的影响。结果：Twist-1在AML及CML患者中的表达水平显著高于对照（均P<0.05），而ALL患者与对照组没有显著差异（P＞0.05）。在K562、U937、KG-1a中过表达及干扰实验证实，Twist-1高表达促进肿瘤细胞增殖、集落形成并抑制细胞凋亡；干扰Twist-1表达则效果相反。结论：Twist-1高表达于AML、CML髓系白血病细胞，并促进白血病细胞的增殖和抑制凋亡。
2016, 23(2):175-181.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.004
摘要:
目的：研究负载α-半乳糖神经酰胺（alpha-galactosylceramide,α-GalCer)的DC功能与成熟度的改变情况，探讨α-GalCer-DC与CIK共培养对CIK细胞表型、增殖活性及杀伤肝癌细胞效率的影响。方法：采用密度梯度离心法从人外周血中分离出单个核细胞，悬浮细胞诱导培养CIK细胞，贴壁细胞诱导培养DC；流式细胞仪检测α-GalCer负载DC的表型，Real-time PCR检测DC相关基因的mRNA表达改变。将α-GalCer-DC与CIK细胞共培养，流式细胞仪检测DC与CIK细胞表面标志物；锥虫蓝染色法检测CIK细胞的增殖倍数；Real-time PCR检测CIK细胞功能相关基因的表达情况；CCK-8试剂盒检测α-GalCer-DC对CIK杀伤HepG2细胞的影响。结果： 经过多种细胞因子诱导，可获得CIK细胞和成熟的DC；α-GalCer负载可促进DC成熟，DC表面标志物CD80、CD86、CD83和CD11c的阳性率均升高（P<0.05或P<0.01），表面趋化因子受体CCR-7、IL-12、IL-10的mRNA水平升高（P<0.05）。α-GalCer-DC与CIK共培养，可显著提高CIK细胞CD3+CD56+的表达和增殖活性（P<0.05或P<0.01），并显著提高INF-γ、IL-12、穿孔素和颗粒酶素B的mRNA表达水平（P<0.05或P<0.01）；CIK、DC-CIK、α-GalCer-DC-CIK细胞对HepG2细胞的杀伤作用随效靶比的升高而增强，在同一效靶比时α-GalCer-DC-CIK细胞对靶细胞的杀伤作用最强（P<0.05）。结论：α-GalCer负载可促进DC成熟，α-GalCer-DC与CIK共培养能促进后者增殖和成熟，能显著增强其对肝癌细胞的杀伤活性，为DC-CIK在肿瘤免疫治疗中的应用提供了实验依据。
目的：研究负载α-半乳糖神经酰胺（alpha-galactosylceramide,α-GalCer)的DC功能与成熟度的改变情况，探讨α-GalCer-DC与CIK共培养对CIK细胞表型、增殖活性及杀伤肝癌细胞效率的影响。方法：采用密度梯度离心法从人外周血中分离出单个核细胞，悬浮细胞诱导培养CIK细胞，贴壁细胞诱导培养DC；流式细胞仪检测α-GalCer负载DC的表型，Real-time PCR检测DC相关基因的mRNA表达改变。将α-GalCer-DC与CIK细胞共培养，流式细胞仪检测DC与CIK细胞表面标志物；锥虫蓝染色法检测CIK细胞的增殖倍数；Real-time PCR检测CIK细胞功能相关基因的表达情况；CCK-8试剂盒检测α-GalCer-DC对CIK杀伤HepG2细胞的影响。结果： 经过多种细胞因子诱导，可获得CIK细胞和成熟的DC；α-GalCer负载可促进DC成熟，DC表面标志物CD80、CD86、CD83和CD11c的阳性率均升高（P<0.05或P<0.01），表面趋化因子受体CCR-7、IL-12、IL-10的mRNA水平升高（P<0.05）。α-GalCer-DC与CIK共培养，可显著提高CIK细胞CD3+CD56+的表达和增殖活性（P<0.05或P<0.01），并显著提高INF-γ、IL-12、穿孔素和颗粒酶素B的mRNA表达水平（P<0.05或P<0.01）；CIK、DC-CIK、α-GalCer-DC-CIK细胞对HepG2细胞的杀伤作用随效靶比的升高而增强，在同一效靶比时α-GalCer-DC-CIK细胞对靶细胞的杀伤作用最强（P<0.05）。结论：α-GalCer负载可促进DC成熟，α-GalCer-DC与CIK共培养能促进后者增殖和成熟，能显著增强其对肝癌细胞的杀伤活性，为DC-CIK在肿瘤免疫治疗中的应用提供了实验依据。
2016, 23(2):182-187.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.005
摘要:
目的：研究4′-甲醚-黄芩素（4′-methylether-scutellarein, 4′-M-S）对耐药性人绒毛膜癌的体内耐药逆转作用并探讨其相关作用机制。 方法： 在BALB/c裸鼠左侧腋窝皮下注射耐药性人绒毛膜癌细胞JAR/VP-16建立耐药性人绒毛膜癌裸鼠皮下移植瘤模型，瘤体直径至1.0 cm时，随机分为空白对照组、依托泊苷（etoposide, VP16）化疗组、4′-M-S组和4′-M-S + VP16联合治疗组，每组10只荷瘤鼠。动态观测各治疗组荷瘤鼠肿瘤生长情况，并记录存活时间。治疗3 周后，通过光镜、透射电镜观察移植瘤组织形态学改变，流式细胞术检测移植瘤细胞凋亡率的变化，用RT-PCR、Western blotting检测并比较4组移植瘤组织中多药耐药基因1（multidrug resistance 1， MDR1 ） mRNA、肺耐药相关蛋白（lung resistance-related protein，LRP）mRNA及其产物P-糖蛋白（permeability-glycoprotein, P-gp）和LRP的表达情况。 结果： 治疗3 周后发现，4′-M-S对耐药性人绒毛膜癌有一定的体内抑制作用，与VP16联合用药可使裸鼠移植瘤生长明显受抑，抑瘤率达48.21%，同时可减轻化疗毒性反应、明显改善荷瘤鼠生活质量，并显著延长其平均存活时间；与其他3组相比，4′-M-S + VP16联合治疗组移植瘤细胞凋亡率显著升高（均P<0.05），移植瘤组织中 MDR1 mRNA、LRP mRNA及其编码蛋白P-gp和LRP表达水平均显著下降（均P<005）。 结论： 4′-M-S能有效逆转人绒毛膜癌对化疗药物VP16的耐药性，其机制可能与4′-M-S诱导细胞凋亡和下调耐药基因 MDR1 mRNA、LRP mRNA及相应产物P-gp和LRP的表达有关。
目的：研究4′-甲醚-黄芩素（4′-methylether-scutellarein, 4′-M-S）对耐药性人绒毛膜癌的体内耐药逆转作用并探讨其相关作用机制。 方法： 在BALB/c裸鼠左侧腋窝皮下注射耐药性人绒毛膜癌细胞JAR/VP-16建立耐药性人绒毛膜癌裸鼠皮下移植瘤模型，瘤体直径至1.0 cm时，随机分为空白对照组、依托泊苷（etoposide, VP16）化疗组、4′-M-S组和4′-M-S + VP16联合治疗组，每组10只荷瘤鼠。动态观测各治疗组荷瘤鼠肿瘤生长情况，并记录存活时间。治疗3 周后，通过光镜、透射电镜观察移植瘤组织形态学改变，流式细胞术检测移植瘤细胞凋亡率的变化，用RT-PCR、Western blotting检测并比较4组移植瘤组织中多药耐药基因1（multidrug resistance 1， MDR1 ） mRNA、肺耐药相关蛋白（lung resistance-related protein，LRP）mRNA及其产物P-糖蛋白（permeability-glycoprotein, P-gp）和LRP的表达情况。 结果： 治疗3 周后发现，4′-M-S对耐药性人绒毛膜癌有一定的体内抑制作用，与VP16联合用药可使裸鼠移植瘤生长明显受抑，抑瘤率达48.21%，同时可减轻化疗毒性反应、明显改善荷瘤鼠生活质量，并显著延长其平均存活时间；与其他3组相比，4′-M-S + VP16联合治疗组移植瘤细胞凋亡率显著升高（均P<0.05），移植瘤组织中 MDR1 mRNA、LRP mRNA及其编码蛋白P-gp和LRP表达水平均显著下降（均P<005）。 结论： 4′-M-S能有效逆转人绒毛膜癌对化疗药物VP16的耐药性，其机制可能与4′-M-S诱导细胞凋亡和下调耐药基因 MDR1 mRNA、LRP mRNA及相应产物P-gp和LRP的表达有关。
2016, 23(2):188-194.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.006
摘要:
目的：探讨热激胃癌细胞来源外泌体致敏树突状细胞（dendritic cells, DCs）诱导的肿瘤特异性细胞毒T细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）反应。方法：制备小鼠前胃癌细胞（ murine foregastric cancer cells，MFC）来源外泌体（Exo）、热激MFC细胞来源外泌体（Exo/HS）及MFC细胞冻融抗原（lysates, Lys），通过电镜观察外泌体的形态，Western blotting检测外泌体的成分。培养小鼠骨髓来源的DCs，将Exo/HS、Exo和Lys冲击致敏DCs，制备的DCs瘤苗分别命名为DC-Exo/HS、DC-Exo和DC-Lys。HSP70小干扰RNA（small interference RNA, siRNA）转染MFC细胞，热激后分离上清，用制备外泌体致敏DCs，流式术检测DCs的表型。以DC-Exo/HS、DC-Exo、DC-Lys、DC和PBS免疫小鼠，3H-TdR法检测脾脏T细胞的增殖，LDH法检测脾细胞CTL活性。建立MFC细胞荷瘤小鼠模型，观察各组DCs瘤苗的免疫治疗效应。结果：电镜确认外泌体为膜性小囊泡。Western blotting检测表明，Exo/HS含有高水平的HSP70，流式术发现热激MFC细胞来源外泌体能显著上调DCs表面MHC-Ⅱ、 CD80、 CD86 和CD40分子的表达， HSP70 siRNA干扰能下调热激MFC细胞来源外泌体刺激的DCs表面 MHC-Ⅱ、CD80、CD86和CD40分子的表达。3H-TdR检测结果显示DC-Exo/HS刺激T细胞增殖的能力显著强于DC-Exo、DC-Lys、DC和PBS组（均P<0.01），LDH检测结果表明DC-Exo/HS诱导的CTL活性显著高于DC-Exo、DC-Lys、DC和PBS组 （均P<0.01）， HSP70 siRNA组诱导的CTL活性显著低于对照siRNA组（P<0.01）。免疫治疗结果显示，DC-Exo/HS对荷瘤小鼠的肿瘤抑制效应显著优于其他各组（P<0.01）。 结论：热激胃癌细胞来源外泌体致敏的DCs能诱导显著的抗肿瘤免疫反应。
目的：探讨热激胃癌细胞来源外泌体致敏树突状细胞（dendritic cells, DCs）诱导的肿瘤特异性细胞毒T细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）反应。方法：制备小鼠前胃癌细胞（ murine foregastric cancer cells，MFC）来源外泌体（Exo）、热激MFC细胞来源外泌体（Exo/HS）及MFC细胞冻融抗原（lysates, Lys），通过电镜观察外泌体的形态，Western blotting检测外泌体的成分。培养小鼠骨髓来源的DCs，将Exo/HS、Exo和Lys冲击致敏DCs，制备的DCs瘤苗分别命名为DC-Exo/HS、DC-Exo和DC-Lys。HSP70小干扰RNA（small interference RNA, siRNA）转染MFC细胞，热激后分离上清，用制备外泌体致敏DCs，流式术检测DCs的表型。以DC-Exo/HS、DC-Exo、DC-Lys、DC和PBS免疫小鼠，3H-TdR法检测脾脏T细胞的增殖，LDH法检测脾细胞CTL活性。建立MFC细胞荷瘤小鼠模型，观察各组DCs瘤苗的免疫治疗效应。结果：电镜确认外泌体为膜性小囊泡。Western blotting检测表明，Exo/HS含有高水平的HSP70，流式术发现热激MFC细胞来源外泌体能显著上调DCs表面MHC-Ⅱ、 CD80、 CD86 和CD40分子的表达， HSP70 siRNA干扰能下调热激MFC细胞来源外泌体刺激的DCs表面 MHC-Ⅱ、CD80、CD86和CD40分子的表达。3H-TdR检测结果显示DC-Exo/HS刺激T细胞增殖的能力显著强于DC-Exo、DC-Lys、DC和PBS组（均P<0.01），LDH检测结果表明DC-Exo/HS诱导的CTL活性显著高于DC-Exo、DC-Lys、DC和PBS组 （均P<0.01）， HSP70 siRNA组诱导的CTL活性显著低于对照siRNA组（P<0.01）。免疫治疗结果显示，DC-Exo/HS对荷瘤小鼠的肿瘤抑制效应显著优于其他各组（P<0.01）。 结论：热激胃癌细胞来源外泌体致敏的DCs能诱导显著的抗肿瘤免疫反应。
2016, 23(2):195-200.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.007
摘要:
目的：研究三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）是否通过抑制髓系来源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）负向调控MDSCs诱导的肿瘤免疫耐受作用。方法： C57BL/6小鼠皮下注射黑素瘤B16细胞和肝癌H22细胞构建移植瘤模型，As2O3处理，观察移植瘤生长情况，流式细胞术检测荷瘤小鼠脾脏内MDSCs和其他免疫细胞的免疫表型，流式细胞术检测2 μmol/L As2O3对B16模型小鼠来源的MDSCs分化的影响。取B16模型小鼠随机分为As2O3处理及对照组，混合淋巴细胞反应检测MDSCs对T细胞免疫抑制活性的改变，ELISA检测B16模型小鼠血清及MDSCs培养上清中TNF-α、IL-10的水平。 结果： As2O3抑制B16和H22模型鼠的肿瘤生长，延长B16模型小鼠的生存期，并可显著下调小鼠脾脏内MDSCs的比例。体外经2 μmol/L As2O3处理5 d后，B16模型小鼠来源的MDSCs中成熟DCs(CD11c+CD40+)的比例较对照组显著升高\[（27.38±457）% vs （17.44±4.51）%，P=0.0078\]；As2O3组来源的MDSCs对T细胞的免疫抑制活性明显低于对照组（P=0.016）；As2O3组小鼠血清及MDSCs培养上清中TNF-α（F=5.78, P=0.014）和IL-10（F=17.83, P=0.045）的含量均较对照组显著降低。 结论：As2O3可通过诱导MDSCs向成熟表型分化、下调其免疫抑制活性等，负调控MDSCs的肿瘤免疫抑制功能。
目的：研究三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）是否通过抑制髓系来源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）负向调控MDSCs诱导的肿瘤免疫耐受作用。方法： C57BL/6小鼠皮下注射黑素瘤B16细胞和肝癌H22细胞构建移植瘤模型，As2O3处理，观察移植瘤生长情况，流式细胞术检测荷瘤小鼠脾脏内MDSCs和其他免疫细胞的免疫表型，流式细胞术检测2 μmol/L As2O3对B16模型小鼠来源的MDSCs分化的影响。取B16模型小鼠随机分为As2O3处理及对照组，混合淋巴细胞反应检测MDSCs对T细胞免疫抑制活性的改变，ELISA检测B16模型小鼠血清及MDSCs培养上清中TNF-α、IL-10的水平。 结果： As2O3抑制B16和H22模型鼠的肿瘤生长，延长B16模型小鼠的生存期，并可显著下调小鼠脾脏内MDSCs的比例。体外经2 μmol/L As2O3处理5 d后，B16模型小鼠来源的MDSCs中成熟DCs(CD11c+CD40+)的比例较对照组显著升高\[（27.38±457）% vs （17.44±4.51）%，P=0.0078\]；As2O3组来源的MDSCs对T细胞的免疫抑制活性明显低于对照组（P=0.016）；As2O3组小鼠血清及MDSCs培养上清中TNF-α（F=5.78, P=0.014）和IL-10（F=17.83, P=0.045）的含量均较对照组显著降低。 结论：As2O3可通过诱导MDSCs向成熟表型分化、下调其免疫抑制活性等，负调控MDSCs的肿瘤免疫抑制功能。
2016, 23(2):201-205.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.008
摘要:
目的：检测miR-129成熟体miR-129-5p在人脑胶质瘤组织中的表达特点，探讨人脑胶质瘤组织中miR-129-2表达异常是否与miR-129-2启动子甲基化有关。方法：收集湘雅医院神经外科2013年10-12月收治的胶质瘤患者肿瘤组织21例、脑外伤患者非肿瘤脑组织标本21例。Real-time PCR检测脑胶质瘤组织和非肿瘤脑组织、脑胶质瘤细胞株和正常脑胶质细胞株中miR-129-5p的表达；甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR，MSP）检测胶质瘤组织中miR-129-2基因启动子甲基化的情况；亚硫酸氢盐硫化测序PCR（bisulfite-sequencing PCR，BSP）分析经甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxycitydine，5-Aza-dC）处理后的胶质瘤细胞miR-129-2基因启动子甲基化水平的变化，同时Real-time PCR检测miR-129-5p的表达变化。结果： miR-129-5p在人脑胶质瘤组织和细胞中表达显著低于非肿瘤脑组织和正常脑胶质细胞（P<005），胶质瘤组织中miR-129-2基因的启动子甲基化率显著高于正常脑组织（P<0.05），使用5-Aza-dC去甲基化处理脑胶质瘤细胞后miR-129-2基因的启动子甲基化程度降低、miR-129-5p表达显著升高（P<0.05）。结论： miR-129-5p在脑胶质瘤中显著低表达，miR-129-2启动子甲基化是导致其低表达的机制之一。
目的：检测miR-129成熟体miR-129-5p在人脑胶质瘤组织中的表达特点，探讨人脑胶质瘤组织中miR-129-2表达异常是否与miR-129-2启动子甲基化有关。方法：收集湘雅医院神经外科2013年10-12月收治的胶质瘤患者肿瘤组织21例、脑外伤患者非肿瘤脑组织标本21例。Real-time PCR检测脑胶质瘤组织和非肿瘤脑组织、脑胶质瘤细胞株和正常脑胶质细胞株中miR-129-5p的表达；甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR，MSP）检测胶质瘤组织中miR-129-2基因启动子甲基化的情况；亚硫酸氢盐硫化测序PCR（bisulfite-sequencing PCR，BSP）分析经甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxycitydine，5-Aza-dC）处理后的胶质瘤细胞miR-129-2基因启动子甲基化水平的变化，同时Real-time PCR检测miR-129-5p的表达变化。结果： miR-129-5p在人脑胶质瘤组织和细胞中表达显著低于非肿瘤脑组织和正常脑胶质细胞（P<005），胶质瘤组织中miR-129-2基因的启动子甲基化率显著高于正常脑组织（P<0.05），使用5-Aza-dC去甲基化处理脑胶质瘤细胞后miR-129-2基因的启动子甲基化程度降低、miR-129-5p表达显著升高（P<0.05）。结论： miR-129-5p在脑胶质瘤中显著低表达，miR-129-2启动子甲基化是导致其低表达的机制之一。
2016, 23(2):206-211.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.009
摘要:
目的：探讨新型纳米材料聚酰胺-胺型树枝状高聚合物（polyamidoamine dendrimer，PAMAM）介导 NK4 基因对乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞生长的抑制作用及对MDA-MB-231细胞移植瘤裸鼠模型的治疗作用。 方法: 制备PAMAM-NK4纳米复合物颗粒，纳米复合物和空载体PAMAM分别转染MDA-MB-231和MCF-7细胞作为实验组和对照组。MTT实验、Western blotting和流式细胞术分别检测转染PAMAM-NK4对细胞增殖、NK4蛋白表达和细胞凋亡的影响。40只雌性裸鼠经皮下注射建立MDA-MB-231细胞移植瘤裸鼠模型，随机分成4组，每组10只裸鼠：空白组肿瘤接种部位旁皮下注射0.2 ml 09% NaCl溶液、空载体组注射0.2 ml含100 μg PAMAM-LacZ 质粒的溶液、给药组注射0.2 ml含100 μg PAMAM-NK4 质粒的溶液、阳性对照组腹腔注射0.2 ml多柔比星(100 μg)溶液。连续注射7 d，第30天处死裸鼠，完整摘除肿瘤，测量肿瘤体积和质量。Western blotting检测各组移植瘤组织NK4蛋白表达。 结果: PAMAM-NK4纳米粒转染MDA-MB-231、MCF-7细胞后能够稳定表达NK4蛋白、抑制细胞增殖和增加细胞凋亡率。成功建立MDA-MB-231细胞移植瘤裸鼠模型，给药组和阳性对照组肿瘤体积及质量显著低于空白组（P＜0.05），且安全性良好；给药组NK4蛋白表达显著高于空白组（P＜0.05）。 结论: PAMAM-NK4纳米粒对乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞生长具有抑制作用，并对人乳腺癌细胞移植瘤裸鼠模型具有治疗作用。
目的：探讨新型纳米材料聚酰胺-胺型树枝状高聚合物（polyamidoamine dendrimer，PAMAM）介导 NK4 基因对乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞生长的抑制作用及对MDA-MB-231细胞移植瘤裸鼠模型的治疗作用。 方法: 制备PAMAM-NK4纳米复合物颗粒，纳米复合物和空载体PAMAM分别转染MDA-MB-231和MCF-7细胞作为实验组和对照组。MTT实验、Western blotting和流式细胞术分别检测转染PAMAM-NK4对细胞增殖、NK4蛋白表达和细胞凋亡的影响。40只雌性裸鼠经皮下注射建立MDA-MB-231细胞移植瘤裸鼠模型，随机分成4组，每组10只裸鼠：空白组肿瘤接种部位旁皮下注射0.2 ml 09% NaCl溶液、空载体组注射0.2 ml含100 μg PAMAM-LacZ 质粒的溶液、给药组注射0.2 ml含100 μg PAMAM-NK4 质粒的溶液、阳性对照组腹腔注射0.2 ml多柔比星(100 μg)溶液。连续注射7 d，第30天处死裸鼠，完整摘除肿瘤，测量肿瘤体积和质量。Western blotting检测各组移植瘤组织NK4蛋白表达。 结果: PAMAM-NK4纳米粒转染MDA-MB-231、MCF-7细胞后能够稳定表达NK4蛋白、抑制细胞增殖和增加细胞凋亡率。成功建立MDA-MB-231细胞移植瘤裸鼠模型，给药组和阳性对照组肿瘤体积及质量显著低于空白组（P＜0.05），且安全性良好；给药组NK4蛋白表达显著高于空白组（P＜0.05）。 结论: PAMAM-NK4纳米粒对乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞生长具有抑制作用，并对人乳腺癌细胞移植瘤裸鼠模型具有治疗作用。
2016, 23(2):212-217.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.010
摘要:
目的：药物表达谱是发现药物新用途的重要模式，本项目探讨药物表达谱模式在结肠癌候选药物筛选中的应用价值。方法：首先，从PubMed的GEO数据库中获取结肠癌表达谱数据集（No.GSE41258），从美国Memorial Sloan-Kettering癌症中心筛选出53对配对的结肠癌与癌旁正常组织样本数据，采用RMAexpress 软件进行质量分析;然后，采用Dchip软件建立结肠癌特征性表达谱；最后通过Connectivity Map(CMAP)进行结肠癌候选化合物的筛选和实验验证。结果：经芯片质量分析，选择36对配对样本进行后续分析；构建了一个由371个基因组成的结肠癌特征性表达谱，其中上调基因94个，下调基因277个；通过CMAP分析，筛选到vorinostat、tanespimycin（17-AAG）等10种候选药物,选择其中一种富集分数较高的药物17-AAG进行验证；后续实验证实17-AAG可有效抑制结肠癌SW480和HT29株细胞的增殖，其作用24和48 h时，SW480细胞的IC50分别为0.73和0.41 μmol/L；而HT29细胞的IC50分别为0.72和0.50 μmol/L。流式术分析显示，17-AAG可使结肠癌细胞阻滞于G1期。结论：本项目基于药物表达谱模式筛选到多种结肠癌候选药物，揭示药物表达谱模式在药物发现中具有重要意义。
目的：药物表达谱是发现药物新用途的重要模式，本项目探讨药物表达谱模式在结肠癌候选药物筛选中的应用价值。方法：首先，从PubMed的GEO数据库中获取结肠癌表达谱数据集（No.GSE41258），从美国Memorial Sloan-Kettering癌症中心筛选出53对配对的结肠癌与癌旁正常组织样本数据，采用RMAexpress 软件进行质量分析;然后，采用Dchip软件建立结肠癌特征性表达谱；最后通过Connectivity Map(CMAP)进行结肠癌候选化合物的筛选和实验验证。结果：经芯片质量分析，选择36对配对样本进行后续分析；构建了一个由371个基因组成的结肠癌特征性表达谱，其中上调基因94个，下调基因277个；通过CMAP分析，筛选到vorinostat、tanespimycin（17-AAG）等10种候选药物,选择其中一种富集分数较高的药物17-AAG进行验证；后续实验证实17-AAG可有效抑制结肠癌SW480和HT29株细胞的增殖，其作用24和48 h时，SW480细胞的IC50分别为0.73和0.41 μmol/L；而HT29细胞的IC50分别为0.72和0.50 μmol/L。流式术分析显示，17-AAG可使结肠癌细胞阻滞于G1期。结论：本项目基于药物表达谱模式筛选到多种结肠癌候选药物，揭示药物表达谱模式在药物发现中具有重要意义。
2016, 23(2):218-222.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.011
摘要:
目的：探讨siRNA靶向沉默 CDX2 基因联合长春新碱（vincristine，VCR）对白血病K562细胞增殖、凋亡的影响。方法： 设计靶向沉默 CDX2 基因表达的特异性siRNA序列CDX2-siRNA-921和相应的阴性对照序列CDX2-siRNA-NC，分别转染K562细胞，同时设正常细胞组做对照。分别应用Real-time PCR和Western blotting法检测转染CDX2-siRNA-921对细胞内 CDX2、BCR-ABL mRNA和蛋白表达的影响；siRNA 和VCR单独或联合作用于K562细胞后，应用MTT、流式细胞术分别检测细胞增殖抑制率、凋亡率的变化。 结果： 与正常细胞组相比，CDX2-siRNA-921能够显著降低目的基因 CDX2 和BCR-ABL mRNA与蛋白的表达（均P<0.05），而CDX2-siRNA-NC组 CDX2 和BCR-ABL mRNA与蛋白表达量无明显变化；与VCR组、CDX2-siRNA-NC组和VCR+CDX2-siRNA-NC组相比，VCR+CDX2-siRNA-921组细胞增殖抑制率降低，凋亡率明显增加（均P<005）。 结论： CDX2-siRN-921能显著降低K562细胞内 CDX2 mRNA和蛋白的表达，并能够下调BCR-ABL融合基因表达水平，同时增强VCR对K562细胞增殖抑制、凋亡诱导作用。
目的：探讨siRNA靶向沉默 CDX2 基因联合长春新碱（vincristine，VCR）对白血病K562细胞增殖、凋亡的影响。方法： 设计靶向沉默 CDX2 基因表达的特异性siRNA序列CDX2-siRNA-921和相应的阴性对照序列CDX2-siRNA-NC，分别转染K562细胞，同时设正常细胞组做对照。分别应用Real-time PCR和Western blotting法检测转染CDX2-siRNA-921对细胞内 CDX2、BCR-ABL mRNA和蛋白表达的影响；siRNA 和VCR单独或联合作用于K562细胞后，应用MTT、流式细胞术分别检测细胞增殖抑制率、凋亡率的变化。 结果： 与正常细胞组相比，CDX2-siRNA-921能够显著降低目的基因 CDX2 和BCR-ABL mRNA与蛋白的表达（均P<0.05），而CDX2-siRNA-NC组 CDX2 和BCR-ABL mRNA与蛋白表达量无明显变化；与VCR组、CDX2-siRNA-NC组和VCR+CDX2-siRNA-NC组相比，VCR+CDX2-siRNA-921组细胞增殖抑制率降低，凋亡率明显增加（均P<005）。 结论： CDX2-siRN-921能显著降低K562细胞内 CDX2 mRNA和蛋白的表达，并能够下调BCR-ABL融合基因表达水平，同时增强VCR对K562细胞增殖抑制、凋亡诱导作用。
2016, 23(2):223-229.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.012
摘要:
目的：探讨环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）及磷酸化CREB（p-CREB）在前列腺癌细胞增殖中的作用。方法: 采用组织芯片技术检测人正常前列腺、前列腺增生、不同分级前列腺癌组织中CREB及p-CREB的表达水平；免疫荧光及Western blotting检测人正常前列腺基质永生化细胞WPMY-1、前列腺癌细胞PC3及LNCap中CREB及p-CREB的表达水平；构建重组人源CREB质粒，并转染PC3及LNCap细胞，Western blotting及CCK-8试剂盒检测转染效率及细胞增殖水平的变化。结果： CREB及p-CREB在前列腺癌组织中表达率明显高于正常前列腺（96% vs 50%,88% vs 40%，P<0.05）和前列腺增生组织（96% vs 80%,88% vs 60%，P<0.05）；CREB及p-CREB蛋白水平在前列腺癌PC3及LNCap细胞中表达量显著高于正常前列腺基质永生化细胞WPMY-1\[PC3细胞：（5.10±0.62） vs （2.31±0.40）、（4.31±054） vs （2.02±0.38）; LNCap细胞：（7.5±0.83） vs （2.31±0.40）、（6.15±0.69） vs （2.02±0.38），均P< 0.05）\]；转染重组质粒CREB可上调前列腺癌细胞PC3及LNCap中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达（均P<005），且转染后的PC3及LNCap细胞增殖水平明显增加（P<005）。结论：CREB及p-CREB在前列腺癌组织、体外培养前列腺癌细胞PC3及LNCap中高表达，并可上调PC3及LNCap中增殖相关基因PCNA的表达，提高细胞增殖水平。
目的：探讨环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）及磷酸化CREB（p-CREB）在前列腺癌细胞增殖中的作用。方法: 采用组织芯片技术检测人正常前列腺、前列腺增生、不同分级前列腺癌组织中CREB及p-CREB的表达水平；免疫荧光及Western blotting检测人正常前列腺基质永生化细胞WPMY-1、前列腺癌细胞PC3及LNCap中CREB及p-CREB的表达水平；构建重组人源CREB质粒，并转染PC3及LNCap细胞，Western blotting及CCK-8试剂盒检测转染效率及细胞增殖水平的变化。结果： CREB及p-CREB在前列腺癌组织中表达率明显高于正常前列腺（96% vs 50%,88% vs 40%，P<0.05）和前列腺增生组织（96% vs 80%,88% vs 60%，P<0.05）；CREB及p-CREB蛋白水平在前列腺癌PC3及LNCap细胞中表达量显著高于正常前列腺基质永生化细胞WPMY-1\[PC3细胞：（5.10±0.62） vs （2.31±0.40）、（4.31±054） vs （2.02±0.38）; LNCap细胞：（7.5±0.83） vs （2.31±0.40）、（6.15±0.69） vs （2.02±0.38），均P< 0.05）\]；转染重组质粒CREB可上调前列腺癌细胞PC3及LNCap中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达（均P<005），且转染后的PC3及LNCap细胞增殖水平明显增加（P<005）。结论：CREB及p-CREB在前列腺癌组织、体外培养前列腺癌细胞PC3及LNCap中高表达，并可上调PC3及LNCap中增殖相关基因PCNA的表达，提高细胞增殖水平。
2016, 23(2):230-234.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.013
摘要:
目的：探讨hsa-miR-99b在胃腺癌细胞系的表达及其影响胃腺癌细胞系增殖和迁移的潜在作用机制。方法: Real-time PCR检测miR-99b在人胃上皮细胞系GES-1和人胃腺癌细胞系SGC-7901、BGC-823、MGC-803中的表达。用人工合成的miR-99b模拟物转染SGC-7901细胞构建过表达miR-996细胞系，转染对照模拟物作为对照组，CCK-8法检测过表达miR-99b的SGC-7901细胞的增殖情况，Transwell 法检测SGC-7901细胞系的迁移情况，Western blotting检测SGC-7901细胞系中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的表达情况。结果:miR-99b在胃腺癌细胞系中的表达水平显著低于胃上皮细胞系，其中以SCG-7901细胞最甚。转染miR-99b模拟物48 h后，实验组SCG-7901细胞增殖能力低于对照组（020±0.00 vs 0.27±0.02，P＜0.05）；与转染对照模拟物的细胞相比，转染24 h后，实验组SCG-7901穿膜细胞数低于对照组\[（226.67±25.17) vs (523.33±25.17)个，P＜0.05\]。miR-99b可下调人胃腺癌细胞系SGC-7901中mTOR蛋白的表达。结论： miR-99b在胃腺癌细胞系中的表达明显下调，miR-99b抑制人胃腺癌细胞系SGC-7901增殖和迁移的作用可能与下调mTOR表达有关。
目的：探讨hsa-miR-99b在胃腺癌细胞系的表达及其影响胃腺癌细胞系增殖和迁移的潜在作用机制。方法: Real-time PCR检测miR-99b在人胃上皮细胞系GES-1和人胃腺癌细胞系SGC-7901、BGC-823、MGC-803中的表达。用人工合成的miR-99b模拟物转染SGC-7901细胞构建过表达miR-996细胞系，转染对照模拟物作为对照组，CCK-8法检测过表达miR-99b的SGC-7901细胞的增殖情况，Transwell 法检测SGC-7901细胞系的迁移情况，Western blotting检测SGC-7901细胞系中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的表达情况。结果:miR-99b在胃腺癌细胞系中的表达水平显著低于胃上皮细胞系，其中以SCG-7901细胞最甚。转染miR-99b模拟物48 h后，实验组SCG-7901细胞增殖能力低于对照组（020±0.00 vs 0.27±0.02，P＜0.05）；与转染对照模拟物的细胞相比，转染24 h后，实验组SCG-7901穿膜细胞数低于对照组\[（226.67±25.17) vs (523.33±25.17)个，P＜0.05\]。miR-99b可下调人胃腺癌细胞系SGC-7901中mTOR蛋白的表达。结论： miR-99b在胃腺癌细胞系中的表达明显下调，miR-99b抑制人胃腺癌细胞系SGC-7901增殖和迁移的作用可能与下调mTOR表达有关。
2016, 23(2):235-242.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.014
摘要:
目的：通过研究ST3 β-半乳糖苷α-2,3唾液酸转移酶5（ST3 β-galactoside α-2,3-sialyltransferase 5 , ST3GAL5）在人急性粒细胞白血病(acute myeloid leukemia, AML) NB4 及其耐药细胞株NB4/ADR的差异表达，明确ST3GAL5对白血病细胞体内及体外药敏性的影响。方法: 采用Real-time PCR和Western blotting技术检测人AML细胞株 ST3GAL5 的表达情况。特异性调控ST3GAL5，MTT及小鼠移植瘤模型实验检测干扰前后NB4和NB4/ADR细胞在体内、外对化疗药物敏感性的变化、PI3K/Akt信号通路的激活情况。结果:ST3GAL5 在亲本细胞株NB4中高表达，在耐药细胞株NB4/ADR中低表达；特异性上调NB4/ADR细胞中ST3GAL5的表达，该细胞的药物敏感性增强（P<0.05），PI3K/Akt信号通路分子和P-gp表达降低（P<005）；特异性下调NB4细胞中ST3GAL5的表达，该细胞的药物敏感性减弱，PI3K/Akt信号通路分子和P-gp表达升高。结论: ST3GAL5在人AML细胞及其耐药细胞株中表达均有显著差异，这些特征性改变与人AML多药耐药有关；AML多药耐药性可能是通过ST3GAL5介导PI3K/Akt信号通路分子和P-gp表达的改变实现。
目的：通过研究ST3 β-半乳糖苷α-2,3唾液酸转移酶5（ST3 β-galactoside α-2,3-sialyltransferase 5 , ST3GAL5）在人急性粒细胞白血病(acute myeloid leukemia, AML) NB4 及其耐药细胞株NB4/ADR的差异表达，明确ST3GAL5对白血病细胞体内及体外药敏性的影响。方法: 采用Real-time PCR和Western blotting技术检测人AML细胞株 ST3GAL5 的表达情况。特异性调控ST3GAL5，MTT及小鼠移植瘤模型实验检测干扰前后NB4和NB4/ADR细胞在体内、外对化疗药物敏感性的变化、PI3K/Akt信号通路的激活情况。结果:ST3GAL5 在亲本细胞株NB4中高表达，在耐药细胞株NB4/ADR中低表达；特异性上调NB4/ADR细胞中ST3GAL5的表达，该细胞的药物敏感性增强（P<0.05），PI3K/Akt信号通路分子和P-gp表达降低（P<005）；特异性下调NB4细胞中ST3GAL5的表达，该细胞的药物敏感性减弱，PI3K/Akt信号通路分子和P-gp表达升高。结论: ST3GAL5在人AML细胞及其耐药细胞株中表达均有显著差异，这些特征性改变与人AML多药耐药有关；AML多药耐药性可能是通过ST3GAL5介导PI3K/Akt信号通路分子和P-gp表达的改变实现。
2016, 23(2):243-249.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.015
摘要:
目的：探讨由慢病毒载体pUL介导的pUL-CDK2-shRNA3(CDK2-shRNA)沉默 CDK2 基因后对小鼠黑素瘤B16-F1细胞恶性生物学行为的影响，初步探索其作用机制。 方法: 利用重组慢病毒载体CDK2-shRNA转染B16-F1细胞，MTT法检测其对细胞增殖的影响，DAPI染色、AnnexinV-FITC/PI双染流式术检测细胞凋亡情况，流式术检测细胞周期变化，细胞黏附实验、transwell 小室实验分别检测细胞黏附、侵袭和迁移能力变化，Western blotting检测细胞周期信号通路上RB蛋白（成视网膜细胞瘤蛋白）、pRB蛋白、细胞周期相关转录因子E2F1及侵袭迁移相关蛋白基质金属酶-2（MMP-2）、基质金属酶-9（MMP-9）的表达水平。 结果: 与空白对照组和阴性对照组相比，CDK2-shRNA组细胞相对增殖率、细胞黏附率、细胞侵袭和迁移能力均显著下降（均P<0.05）。细胞凋亡率显著增加（均P<0.05）； G1期细胞显著增加而S期和G2期显著降低（P<0.05）。细胞周期相关蛋白pRB、E2F1明显降低而RB显著升高（P<0.05），细胞侵袭和迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9明显降低（P<005）。 结论: 慢病毒载体pUL介导的shRNA沉默 CDK2 基因对B16-F1细胞恶性生物学行为有显著的抑制作用，其机制主要与细胞周期和细胞侵袭迁移相关蛋白表达变化有关。
目的：探讨由慢病毒载体pUL介导的pUL-CDK2-shRNA3(CDK2-shRNA)沉默 CDK2 基因后对小鼠黑素瘤B16-F1细胞恶性生物学行为的影响，初步探索其作用机制。 方法: 利用重组慢病毒载体CDK2-shRNA转染B16-F1细胞，MTT法检测其对细胞增殖的影响，DAPI染色、AnnexinV-FITC/PI双染流式术检测细胞凋亡情况，流式术检测细胞周期变化，细胞黏附实验、transwell 小室实验分别检测细胞黏附、侵袭和迁移能力变化，Western blotting检测细胞周期信号通路上RB蛋白（成视网膜细胞瘤蛋白）、pRB蛋白、细胞周期相关转录因子E2F1及侵袭迁移相关蛋白基质金属酶-2（MMP-2）、基质金属酶-9（MMP-9）的表达水平。 结果: 与空白对照组和阴性对照组相比，CDK2-shRNA组细胞相对增殖率、细胞黏附率、细胞侵袭和迁移能力均显著下降（均P<0.05）。细胞凋亡率显著增加（均P<0.05）； G1期细胞显著增加而S期和G2期显著降低（P<0.05）。细胞周期相关蛋白pRB、E2F1明显降低而RB显著升高（P<0.05），细胞侵袭和迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9明显降低（P<005）。 结论: 慢病毒载体pUL介导的shRNA沉默 CDK2 基因对B16-F1细胞恶性生物学行为有显著的抑制作用，其机制主要与细胞周期和细胞侵袭迁移相关蛋白表达变化有关。
2016, 23(2):250-254.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.016
摘要:
目的：探讨趋化因子CXCL12及其受体CXCR4（CXCL12/CXCR4）生物学轴通过细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号转导通路发挥促子宫内膜癌细胞增殖和侵袭的作用。 方法：应用外源性CXCL12处理子宫内膜癌Ishikawa细胞株，通过Western blotting检测不同时间位点ERK1/2的磷酸化水平和Survivin蛋白的表达；通过ELISA检测细胞培养上清液中MMP-2的分泌水平。同时分析AMD3100和PD98059对细胞ERK1/2磷酸化水平、Survivin蛋白水平和MMP-2分泌水平的影响。 结果：外源性CXCL12刺激后，可迅速上调ERK1/2的磷酸化水平（t=0.887，P<0.01），促进Survivin蛋白和MMP-2蛋白的表达（t=0.861，P<0.01； t=0.297，P<0.01），且三者均呈时间依赖性。PD98059和AMD3100均能明显抑制外源性CXCL12诱导后ERK1/2的磷酸化水平，而且在两者共同作用下，能完全抑制ERK1/2的磷酸化水平，阻断ERK通路的激活，下调Survivin蛋白和MMP-2蛋白的表达。结论：CXCL12/CXCR4生物学轴通过激活ERK通路上调Survivin蛋白和MMP-2蛋白表达，从而引发Ishikawa细胞一系列增殖和侵袭的生物学效应。
目的：探讨趋化因子CXCL12及其受体CXCR4（CXCL12/CXCR4）生物学轴通过细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号转导通路发挥促子宫内膜癌细胞增殖和侵袭的作用。 方法：应用外源性CXCL12处理子宫内膜癌Ishikawa细胞株，通过Western blotting检测不同时间位点ERK1/2的磷酸化水平和Survivin蛋白的表达；通过ELISA检测细胞培养上清液中MMP-2的分泌水平。同时分析AMD3100和PD98059对细胞ERK1/2磷酸化水平、Survivin蛋白水平和MMP-2分泌水平的影响。 结果：外源性CXCL12刺激后，可迅速上调ERK1/2的磷酸化水平（t=0.887，P<0.01），促进Survivin蛋白和MMP-2蛋白的表达（t=0.861，P<0.01； t=0.297，P<0.01），且三者均呈时间依赖性。PD98059和AMD3100均能明显抑制外源性CXCL12诱导后ERK1/2的磷酸化水平，而且在两者共同作用下，能完全抑制ERK1/2的磷酸化水平，阻断ERK通路的激活，下调Survivin蛋白和MMP-2蛋白的表达。结论：CXCL12/CXCR4生物学轴通过激活ERK通路上调Survivin蛋白和MMP-2蛋白表达，从而引发Ishikawa细胞一系列增殖和侵袭的生物学效应。
2016, 23(2):255-260.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.017
摘要:
目的：探讨CD3和CD28单克隆抗体联合作用对细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer，CIK)细胞及其亚群增殖及功能的影响。方法：采集2014年6月至2015年6月在郑州大学第一附属医院接受生物细胞治疗的20例肿瘤患者（肾癌6例，肺癌5例，肝癌、乳腺癌和恶性黑素瘤各2例，胆囊癌、淋巴瘤和卵巢癌各1例）的外周血，每例外周血均分为4组（对照组，单用CD3单抗组，单用CD28单抗组，CD3和CD28单抗联合作用组）进行CIK细胞的诱导培养。用CFSE染色检测CIK细胞的增殖能力；ELISA检测CIK细胞分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的水平；磁珠分选CIK细胞亚群CD4+、CD8+和CD56+细胞，然后用ELISA检测对CIK细胞亚群分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2能力的影响。结果： CD3/CD28单抗联合作用（PI=5935）对CIK细胞的增殖能力的影响与单独使用CD3单抗（PI=64.4）相比效果并不明显，但是可以刺激CIK细胞分泌较高水平的IFN-γ和TNF-α\[IFN-γ: (384.6±2631) vs (201.5±271.5) pg/ml, P=0.0361; TNF-α: (4.795±1.251) vs (2.835±0.443) pg/ml, P=0.0265\]；进一步分析发现，两单抗的联合作用可增强亚群细胞CD8+分泌IFN-γ、CD56+分泌IL-2和TNF-α 的活性，从而起到对淋巴细胞功能的增强作用。结论： CD3与CD28单抗联合作用不能增强CIK的增殖能力,但可以在一定程度上增强CIK细胞的功能，在肿瘤的细胞免疫治疗应用中具有一定的潜力。
目的：探讨CD3和CD28单克隆抗体联合作用对细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer，CIK)细胞及其亚群增殖及功能的影响。方法：采集2014年6月至2015年6月在郑州大学第一附属医院接受生物细胞治疗的20例肿瘤患者（肾癌6例，肺癌5例，肝癌、乳腺癌和恶性黑素瘤各2例，胆囊癌、淋巴瘤和卵巢癌各1例）的外周血，每例外周血均分为4组（对照组，单用CD3单抗组，单用CD28单抗组，CD3和CD28单抗联合作用组）进行CIK细胞的诱导培养。用CFSE染色检测CIK细胞的增殖能力；ELISA检测CIK细胞分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的水平；磁珠分选CIK细胞亚群CD4+、CD8+和CD56+细胞，然后用ELISA检测对CIK细胞亚群分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2能力的影响。结果： CD3/CD28单抗联合作用（PI=5935）对CIK细胞的增殖能力的影响与单独使用CD3单抗（PI=64.4）相比效果并不明显，但是可以刺激CIK细胞分泌较高水平的IFN-γ和TNF-α\[IFN-γ: (384.6±2631) vs (201.5±271.5) pg/ml, P=0.0361; TNF-α: (4.795±1.251) vs (2.835±0.443) pg/ml, P=0.0265\]；进一步分析发现，两单抗的联合作用可增强亚群细胞CD8+分泌IFN-γ、CD56+分泌IL-2和TNF-α 的活性，从而起到对淋巴细胞功能的增强作用。结论： CD3与CD28单抗联合作用不能增强CIK的增殖能力,但可以在一定程度上增强CIK细胞的功能，在肿瘤的细胞免疫治疗应用中具有一定的潜力。
2016, 23(2):261-266.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.018
摘要:
目的：检测贲门腺癌（gastric cardia adenocarcinoma, GCA）及相应癌旁非肿瘤组织中β-环连蛋白抑制基因1（dishevelled-binding antagonist of beta-catenin 1，DACT-1）的甲基化状态，并探讨其临床意义。方法： 应用甲基化特异性PCR（methylation specific PCR, MSP）、定量RT-PCR的方法分别检测112例贲门腺癌（河北医科大学第四医院外科和磁县肿瘤医院胸外科于2006-2014年收治）及相应癌旁非肿瘤组织中 DACT-1 基因的甲基化状态及其mRNA表达情况。 结果： 在贲门腺癌组织中， DACT-1 基因的甲基化率为51.8%(58/112)，癌旁非肿瘤组织中该基因的甲基化率为17.6%(20/112)，癌组织中DACT-1 基因发生甲基化的频率明显高于癌旁非肿瘤组织（P<0.01）； 癌组织中DACT-1 基因mRNA的表达量为0.580±0143，明显低于癌旁非肿瘤组织(0.654±0.110，P<0.01)；在 DACT-1 基因甲基化的贲门癌组织中该基因mRNA的表达量为0.488±0097，明显低于该基因未甲基化的贲门癌组织(0.675±0.120)，且该基因甲基化状态与其mRNA表达量相关（P<001)。癌组织中 DACT-1 基因的高甲基化状态与肿瘤患者的淋巴结转移情况及上消化道肿瘤家族史有关（P<0.05），而与肿瘤患者的年龄、性别及肿瘤组织的病理分级、临床分期均无关（P>0.05）。 结论： 贲门腺癌中基因CpG岛的高甲基化可能是 DACT-1 基因表达下调的机制之一； DACT-1 基因启动子区的甲基化状态有望为贲门腺癌临床辅助诊断和预后评估提供新的指标。
目的：检测贲门腺癌（gastric cardia adenocarcinoma, GCA）及相应癌旁非肿瘤组织中β-环连蛋白抑制基因1（dishevelled-binding antagonist of beta-catenin 1，DACT-1）的甲基化状态，并探讨其临床意义。方法： 应用甲基化特异性PCR（methylation specific PCR, MSP）、定量RT-PCR的方法分别检测112例贲门腺癌（河北医科大学第四医院外科和磁县肿瘤医院胸外科于2006-2014年收治）及相应癌旁非肿瘤组织中 DACT-1 基因的甲基化状态及其mRNA表达情况。 结果： 在贲门腺癌组织中， DACT-1 基因的甲基化率为51.8%(58/112)，癌旁非肿瘤组织中该基因的甲基化率为17.6%(20/112)，癌组织中DACT-1 基因发生甲基化的频率明显高于癌旁非肿瘤组织（P<0.01）； 癌组织中DACT-1 基因mRNA的表达量为0.580±0143，明显低于癌旁非肿瘤组织(0.654±0.110，P<0.01)；在 DACT-1 基因甲基化的贲门癌组织中该基因mRNA的表达量为0.488±0097，明显低于该基因未甲基化的贲门癌组织(0.675±0.120)，且该基因甲基化状态与其mRNA表达量相关（P<001)。癌组织中 DACT-1 基因的高甲基化状态与肿瘤患者的淋巴结转移情况及上消化道肿瘤家族史有关（P<0.05），而与肿瘤患者的年龄、性别及肿瘤组织的病理分级、临床分期均无关（P>0.05）。 结论： 贲门腺癌中基因CpG岛的高甲基化可能是 DACT-1 基因表达下调的机制之一； DACT-1 基因启动子区的甲基化状态有望为贲门腺癌临床辅助诊断和预后评估提供新的指标。
2016, 23(2):267-275.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.019
摘要:
目的：采用Meta分析评估miR-17-92簇高表达在肿瘤患者预后中的价值。方法：检索Web of Science、PubMed、EMBASE数据库从建库至2015年10月1日关于miR-17-92簇成员高表达与恶性肿瘤患者预后关系的英文文献，提取关键数据,计算合并风险比(hazard ratio，HR)及其95%置信区间(confidence interval,CI)。结果：共纳入39篇文献,包含4 908例患者。miR-17-92簇的高表达与恶性肿瘤患者总生存率 (HR=1.83,95%CI: 1.58~2.12,P=0.000)低有关，并且miR-17-92簇高表达的肿瘤患者的无病生存率(HR=1.80 ,95% CI:1.43~2.26,P=0.000)、无进展生存率(HR=1.83,95%CI:1.11~302,P=0.018)及肿瘤特异性生存率(HR=1.59，95%CI:1.04~2.42,P=0.032)均降低；然而无复发生存率的合并风险比无统计学意义(P=0.539)。结论：miR-17-92簇高表达与恶性肿瘤患者的不良预后有关，有望成为新型肿瘤预后标志物。
目的：采用Meta分析评估miR-17-92簇高表达在肿瘤患者预后中的价值。方法：检索Web of Science、PubMed、EMBASE数据库从建库至2015年10月1日关于miR-17-92簇成员高表达与恶性肿瘤患者预后关系的英文文献，提取关键数据,计算合并风险比(hazard ratio，HR)及其95%置信区间(confidence interval,CI)。结果：共纳入39篇文献,包含4 908例患者。miR-17-92簇的高表达与恶性肿瘤患者总生存率 (HR=1.83,95%CI: 1.58~2.12,P=0.000)低有关，并且miR-17-92簇高表达的肿瘤患者的无病生存率(HR=1.80 ,95% CI:1.43~2.26,P=0.000)、无进展生存率(HR=1.83,95%CI:1.11~302,P=0.018)及肿瘤特异性生存率(HR=1.59，95%CI:1.04~2.42,P=0.032)均降低；然而无复发生存率的合并风险比无统计学意义(P=0.539)。结论：miR-17-92簇高表达与恶性肿瘤患者的不良预后有关，有望成为新型肿瘤预后标志物。
2016, 23(2):276-281.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.020
摘要:
目的：探讨食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）患者肿瘤组织和引流淋巴结（tumor draining lymph node, TDLN）组织吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO）和桥接整合因子1（bridging integrator 1, BIN1）的表达及其在ESCC进展中的意义。方法：收集2013年4月至2014年7月在河北医科大学第四医院胸外科行肿瘤切除并经病理证实的71例ESCC患者的肿瘤组织、癌旁组织和TDLN标本，其中肿瘤组织以癌旁组织作为对照组，转移淋巴结以未转移淋巴结作为对照组，均采用Real-time PCR法和免疫组化法检测IDO和BIN1表达情况，分析两者表达的相关性及其与患者临床特征的关系。结果：与未转移淋巴结相比，转移淋巴结中IDO mRNA表达水平和蛋白阳性表达率均显著增高（047±014 vs 0.22±0.09，P<0.01; 90.91% vs 67.35%, P=0.042），而 BIN1 mRNA表达水平和蛋白阳性表达率均显著降低（0.15±0.11 vs 0.35±0.15, P<0.01；50.00% vs 77.55%, P=0.028）。与癌旁组织相比，肿瘤组织中 IDO mRNA表达水平和蛋白阳性表达率均显著增高（0.51±0.12 vs 0.24±0.11, P<0.01; 81.69% vs 22.54%, P<0.01），而 BIN1 mRNA表达水平和蛋白阳性表达率均显著降低（0.17±0.10 vs 0.41±0.14, P<0.01; 19.72% vs 80.28%, P=0.006）。肿瘤组织和TDLN中，IDO蛋白表达与肿瘤侵犯范围、淋巴结转移、临床分期相关，而BIN1蛋白表达与肿瘤分化程度、侵犯范围、淋巴结转移、临床分期相关。结论： ESCC患者肿瘤组织和转移TDLN中IDO表达水平显著提高、BIN1表达水平显著降低与患者临床特征密切相关，可能是影响ESCC进展的重要因素。
目的：探讨食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）患者肿瘤组织和引流淋巴结（tumor draining lymph node, TDLN）组织吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO）和桥接整合因子1（bridging integrator 1, BIN1）的表达及其在ESCC进展中的意义。方法：收集2013年4月至2014年7月在河北医科大学第四医院胸外科行肿瘤切除并经病理证实的71例ESCC患者的肿瘤组织、癌旁组织和TDLN标本，其中肿瘤组织以癌旁组织作为对照组，转移淋巴结以未转移淋巴结作为对照组，均采用Real-time PCR法和免疫组化法检测IDO和BIN1表达情况，分析两者表达的相关性及其与患者临床特征的关系。结果：与未转移淋巴结相比，转移淋巴结中IDO mRNA表达水平和蛋白阳性表达率均显著增高（047±014 vs 0.22±0.09，P<0.01; 90.91% vs 67.35%, P=0.042），而 BIN1 mRNA表达水平和蛋白阳性表达率均显著降低（0.15±0.11 vs 0.35±0.15, P<0.01；50.00% vs 77.55%, P=0.028）。与癌旁组织相比，肿瘤组织中 IDO mRNA表达水平和蛋白阳性表达率均显著增高（0.51±0.12 vs 0.24±0.11, P<0.01; 81.69% vs 22.54%, P<0.01），而 BIN1 mRNA表达水平和蛋白阳性表达率均显著降低（0.17±0.10 vs 0.41±0.14, P<0.01; 19.72% vs 80.28%, P=0.006）。肿瘤组织和TDLN中，IDO蛋白表达与肿瘤侵犯范围、淋巴结转移、临床分期相关，而BIN1蛋白表达与肿瘤分化程度、侵犯范围、淋巴结转移、临床分期相关。结论： ESCC患者肿瘤组织和转移TDLN中IDO表达水平显著提高、BIN1表达水平显著降低与患者临床特征密切相关，可能是影响ESCC进展的重要因素。
2016, 23(2):282-286.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.021
摘要:
Notch信号通路是一种在进化中较为保守的信号通路，在多种生命活动中发挥重要作用。目前研究认为，Notch信号参与了免疫细胞的生长、分化和发育等多个环节的调控，其在B细胞的分化发育过程以及相关肿瘤的发生发展中起到重要的调控作用。本文对Notch信号在B细胞的不同分化发育阶段如淋巴祖细胞（common lymphoid progenitor，CLP）、边缘区B细胞（marginal zone B cell，MZ B）、滤泡B细胞（follicular B cell，FO B）、B-1 B细胞，以及B细胞淋巴瘤中的作用进行了综述。
Notch信号通路是一种在进化中较为保守的信号通路，在多种生命活动中发挥重要作用。目前研究认为，Notch信号参与了免疫细胞的生长、分化和发育等多个环节的调控，其在B细胞的分化发育过程以及相关肿瘤的发生发展中起到重要的调控作用。本文对Notch信号在B细胞的不同分化发育阶段如淋巴祖细胞（common lymphoid progenitor，CLP）、边缘区B细胞（marginal zone B cell，MZ B）、滤泡B细胞（follicular B cell，FO B）、B-1 B细胞，以及B细胞淋巴瘤中的作用进行了综述。
2016, 23(2):287-290.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.022
摘要:
T细胞基因转导方法的快速发展为肿瘤过继免疫治疗插上了飞翔的翅膀，近年来取得的颠覆性治疗效果让人们对它充满期待。T细胞的基因转导具有挑战性，以逆转录病毒、慢病毒、转座子和mRNA电穿孔为代表的技术进步，释放了T细胞的治疗潜能，实现了对肿瘤细胞精准、高效、持久地杀伤，大大提升了临床级肿瘤特异性T细胞的临床效果；但仍面临插入突变、转导效率、成本等方面的问题。相信随着相关基础研究的深入，T细胞基因转导“完美载体”的出现将会助力免疫治疗成为一线主流的肿瘤治疗方法。
T细胞基因转导方法的快速发展为肿瘤过继免疫治疗插上了飞翔的翅膀，近年来取得的颠覆性治疗效果让人们对它充满期待。T细胞的基因转导具有挑战性，以逆转录病毒、慢病毒、转座子和mRNA电穿孔为代表的技术进步，释放了T细胞的治疗潜能，实现了对肿瘤细胞精准、高效、持久地杀伤，大大提升了临床级肿瘤特异性T细胞的临床效果；但仍面临插入突变、转导效率、成本等方面的问题。相信随着相关基础研究的深入，T细胞基因转导“完美载体”的出现将会助力免疫治疗成为一线主流的肿瘤治疗方法。
2016, 23(2):291-296.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.023
摘要:
微小RNA（microRNA，miRNA）是目前肿瘤相关研究的热点，人类基因组中约有三分之一的基因受miRNAs调控。miR-370参与调节脂类代谢和肿瘤的发生、发展、耐药和转移，并发挥“癌基因”或“抑癌基因”的功能。越来越多的研究表明miR-370在人类多种肿瘤中异常表达，近年来也有研究认为脂类代谢异常是肿瘤形成的原因之一。本文就miR-370在肿瘤发生发展、复发转移和耐药中的作用及其作用机制进行综述。
微小RNA（microRNA，miRNA）是目前肿瘤相关研究的热点，人类基因组中约有三分之一的基因受miRNAs调控。miR-370参与调节脂类代谢和肿瘤的发生、发展、耐药和转移，并发挥“癌基因”或“抑癌基因”的功能。越来越多的研究表明miR-370在人类多种肿瘤中异常表达，近年来也有研究认为脂类代谢异常是肿瘤形成的原因之一。本文就miR-370在肿瘤发生发展、复发转移和耐药中的作用及其作用机制进行综述。
2016, 23(2):297-302.
DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.024
摘要:
长链非编码RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一类长度超过200个核苷酸而无蛋白质编码功能的RNA分子，其在食管癌细胞的表观遗传学、转录及转录后水平参与基因的表达调控，在肿瘤的发生、发展、浸润和转移等过程中发挥致癌或抑癌基因的作用。本文就HOX转录反义RNA（HOX transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR）、H19、肺腺癌转移相关转录子1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript l，MALAT1）等促癌相关lncRNAs，Epist等抑癌相关lncRNAs，边缘系统相关膜蛋白反义RNA3（limbicsystem-associated membrane protein antisense RNA3, LOC285194）及人类BOK反义RNA1（BOK antisense RNA 1，BOKAS1）等放化疗相关lncRNAs在食管癌中作用的研究进展作一综述。
长链非编码RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一类长度超过200个核苷酸而无蛋白质编码功能的RNA分子，其在食管癌细胞的表观遗传学、转录及转录后水平参与基因的表达调控，在肿瘤的发生、发展、浸润和转移等过程中发挥致癌或抑癌基因的作用。本文就HOX转录反义RNA（HOX transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR）、H19、肺腺癌转移相关转录子1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript l，MALAT1）等促癌相关lncRNAs，Epist等抑癌相关lncRNAs，边缘系统相关膜蛋白反义RNA3（limbicsystem-associated membrane protein antisense RNA3, LOC285194）及人类BOK反义RNA1（BOK antisense RNA 1，BOKAS1）等放化疗相关lncRNAs在食管癌中作用的研究进展作一综述。
联系方式
- 《中国肿瘤生物治疗杂志》
- 1994年创刊
- 主办单位：中国免疫学会、中国抗癌学会
- 邮编：200433
- 电话：021-81871002-22
- 电子邮箱：cjcb@biother.cn
- 网址:http://www.biother.cn
- 刊号：ISSN 1007-385X
- CN 31-1725/R
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