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专家论坛
细胞治疗产品中关键原材料风险控制策略的审评考虑
尹慧芳，卢加琪，张景辰，韦薇
2024,31(10):943-950, DOI:
[摘要] (40) [HTML] (0) [PDF 1.40 M] (79)
摘要：
以嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞（CAR-T细胞）为代表的免疫细胞治疗产品已经在白血病等血液瘤中取得了重 大进步。细胞治疗产品的生产原材料种类多样，成分复杂，其中基因修饰载体和其他一些赋予细胞特定功能或影响其质量的原 材料通常为关键原材料。这些关键原材料往往会对细胞治疗产品的质量属性和体内疗效产生重要的影响，因此是细胞治疗产品 审评的重要关注点。本文论述了细胞治疗产品中常用的几种关键原材料（包括慢病毒载体和γ-逆转录病毒载体、CRISPR/Cas编 辑系统、转座子系统、分选磁珠和滋养细胞），提出了目前的审评考虑和风险控制策略，以期促进此类产品的临床转化和应用。
基础研究
IL-7的诱导表达增强靶向GPC3 CAR-T细胞的增殖及体外抗肿瘤活性
龚福生，陈珊珊，郑秋红，刘沁颖
2024,31(10):951-956, DOI:
[摘要] (37) [HTML] (0) [PDF 1.64 M] (51)
摘要：
目的：探讨IL-7的诱导表达对靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞（CAR-T细胞） 的增殖和体外抗肿瘤活性的影响。方法：通过无缝克隆将GPC3 CAR序列片段插入GV400载体的BamHⅠ/EcoRⅠ位置，构建第 二代CAR慢病毒载体GPC3-BBZ及GPC3-BBZ-NFAT-IL-7，以293T细胞包装相应的慢病毒载体后，感染人T细胞制备CAR-T细 胞。实验分为未转导T细胞（NT）组、GPC3- BBZ CAR-T细胞组、GPC3-BBZ-NFAT-IL-7 CAR-T细胞组。采用流式细胞术检测各 组CAR-T细胞中CAR的表达水平，qPCR 法检测经 GPC3 蛋白激活的 CAR-T 细胞中 IL-7 mRNA的表达水平，细胞计数法检测 CAR-T细胞在GPC3抗原刺激下的增殖能力，ELISA检测CAR-T细胞在受到肿瘤细胞刺激后IL-7、IFN-γ和TNF-α的分泌水平。 应用实时细胞分析（RTCA）技术检测CAR-T细胞对人肝癌Huh-7细胞的杀伤作用。结果：成功构建慢病毒载体GPC3-BBZ和 GPC3-BBZ-NFAT-IL-7，制备出靶向GPC3 的 CAR-T 细胞。经 GPC3 抗原激活后，GPC3-BBZ-NFAT-IL-7 CAR-T细胞可有效表 达IL-7 mRNA（P < 0.01），其表现出更强的增殖能力（P < 0.05）。与GPC3-BBZ CAR-T 细胞相比，GPC3-BBZ-NFAT-IL-7 CAR-T 细胞与GPC3阳性靶细胞Huh-7细胞共培养后，分泌更高水平的IL-7、IFN-γ和TNF-α（P < 0.01或P < 0.001）。RTCA结果显示， GPC3-BBZ-NFAT-IL-7 CAR-T细胞对GPC3阳性Huh-7细胞的杀伤活性显著高于GPC3-BBZ CAR-T细胞（P < 0.05）。结论：成 功制备可诱导表达IL-7的靶向GPC3的CAR-T细胞，IL-7的诱导表达增强靶向GPC3 CAR-T细胞的免疫活性，在体外展现出较强的 肿瘤细胞杀伤能力。
紫草素联合肿瘤细胞裂解物刺激DC疫苗的抗肿瘤效果
李鹏飞，张燕丽，杨依，张敏
2024,31(10):957-962, DOI:
[摘要] (19) [HTML] (0) [PDF 2.16 M] (42)
摘要：
目的：探讨紫草素（SK）联合肿瘤细胞裂解物（TCL）刺激的DC疫苗的抗肿瘤效果。方法：体外制备SK和TCL刺激 的正常小鼠源的DC疫苗，流式细胞术检测DC表面CD80、CD86的荧光强度。流式细胞术检测与SK + TCL刺激的DC共培养后 的正常小鼠脾T细胞中T-bet和RORγt的表达，ELISA检测共培养上清液中IFN-γ、IL-12P70和TNF-α的含量。建立Lewis肺癌 3LL细胞荷瘤小鼠模型，分为PBS（1 mL）+ TCL（5 × 105 个细胞/100 μL）、SK-L（1.25 mg/kg） + TCL、SK-M（2.5 mg/kg） + TCL、SK-H （5 mg/kg） + TCL、紫杉醇（PTX 2 mg/kg） + TCL疫苗组。疫苗接种结束后10 d，检测移植瘤体积和小鼠生存率，LDH法检测脾 CTL的杀伤能力。结果：SK + TCL刺激的DC疫苗表达出高水平 CD80、CD86（均 P < 0.01）；DC 与 T 细胞共培养液上清中 IL-12P70、IFN-γ、TNF-α含量均显著上升（均P < 0.01），T细胞中T-bet和RORγt的表达显著性上调（均P < 0.01）。成功构建Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型，SK-H + TCL刺激的DC疫苗治疗显著延缓了的移植瘤生长并提高了小鼠的存活率，且可强烈诱导脾CTL的 杀伤能力（均P < 0.01）。结论：SK + TCL刺激的DC疫苗可激活DC至成熟状态，上调T细胞中T-bet和RORγt的表达，启动Th1 效应细胞，SK体内治疗Lewis肺癌荷瘤小鼠具有良好的抗肿瘤效果。
小鼠结肠癌新抗原Glud1-V546I及其DC疫苗能够在体内和体外诱导有 效的抗肿瘤免疫应答
徐淑华，赵婕，苗红霞，孙伟红，赵鹏，牛爱荣
2024,31(10):963-969, DOI:
[摘要] (33) [HTML] (0) [PDF 1.63 M] (52)
摘要：
目的：开发针对结直肠癌（CRC）个性化治疗的新抗原肽疫苗，探讨新抗原肽及其诱导的新抗原反应性T（NRT）细胞 治疗CRC的可行性和有效性。方法：提取小鼠结肠癌CT26细胞的DNA和RNA，采用全外显子和转录组测序分析肿瘤基因的 突变及表达。通过基于机器学习的新抗原预测体系，筛选、合成具有高免疫原性多肽。用合成的多肽经皮下注射免疫小鼠，通过 流式细胞术检测免疫鼠脾细胞的IFN-γ分泌水平，筛选具有强免疫原性多肽。用免疫原性多肽负载小鼠骨髓来源的树突状细胞 （BMDC）免疫结肠癌建模小鼠，通过ELISPOT检测效应细胞分泌IFN-γ的能力，时间分辨荧光免疫分析法检测免疫鼠脾细胞对 相应靶细胞的杀伤力，观察荷瘤小鼠肿瘤生长情况和小鼠存活期。结果：新抗原肽Glud1-V546I具有更强的诱导NRT细胞分泌 IFN-γ的能力（P < 0.000 1）。与野生肽（Glud1-WT）相比，Glud1-V546I 在荷瘤鼠体内诱导的 NRT 细胞有更高的IFN-γ分泌能 力（P ）和细胞毒作用（P < 0.000 1）。同时，Glud1-V546I能明显抑制小鼠肿瘤生长（P < 0.001）并延长荷瘤鼠的生存期 （P < 0.01）。结论：小鼠CT26细胞的新抗原肽Glud1-V546I能够显著促进小鼠NRT细胞的IFN-γ的分泌，用其制备的DC疫苗在 结肠癌荷瘤鼠体内显示出有效的抗肿瘤反应，提示开发基于新抗原的CRC个性化免疫治疗是可能的。
临床研究
DC-CIK不同输注方式治疗原发性肝癌的临床疗效和预后
吴文清，江龙委，贾绍昌，胡建华，柯传庆，张浩利，付慧英，熊勰
2024,31(10):970-975, DOI:
[摘要] (19) [HTML] (0) [PDF 1.23 M] (39)
摘要：
目的：探讨不同途径输注DC-CIK对中晚期原发性肝癌（PLC）的治疗效果和预后价值。方法：回顾性分析2018年 10月至2021年9月间东部战区总医院肿瘤科DC-CIK治疗的69例中晚期PLC患者的临床资料，根据DC-CIK治疗时采用的输注 方式不同将患者分为肝动脉灌注（HAI）组（n = 29）和静脉输注（IV）组（n = 40），比较两组患者的临床疗效、外周血T淋巴细胞亚 群（CD3+ 、CD4 + 、CD8 + T和CD4+ /CD8+ T细胞比值），以及细胞因子（IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α）、甲胎蛋白（AFP）的变化、总生存期 （OS）和不良反应发生情况。结果：69例PLC患者经DC-CIK治疗后，HAI组患者的客观缓解率（ORR）为0%，疾病控制率（DCR） 为75.8%；IV组患者的ORR为0%，DCR为72.5%（P > 0.05）。两组患者治疗前后T淋巴细胞亚群指标变化差异无统计学意义（均 P > 0.05），两组患者治疗后外周血IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α的平均水平均显著高于治疗前（均P < 0.01），两组间比较无显著差异 （P > 0.05）；HAI组患者平均OS为48.17个月，IV组OS为39.65个月，两组间比较无显著差异（P > 0.05）。治疗过程中无严重不良 反应发生。结论：自体DC-CIK HAI治疗PLC安全有效，较IV治疗有提升临床获益的趋势，值得临床借鉴。
基础研究
FHL2与LDHA相互作用促进胶质瘤细胞的增殖
吴国庆，张婷，宋小锋，朱婷，李娜，李明
2024,31(10):976-983, DOI:
[摘要] (23) [HTML] (0) [PDF 4.98 M] (40)
摘要：
目的：探讨四个半LIM结构域2（FHL2）蛋白对胶质瘤细胞增殖的影响及其分子机制。方法：利用TCGA和CGGA 数据库分析胶质瘤组织中FHL2 mRNA表达水平与患者预后的关系。通过WB法检测人胶质瘤组织标本及人胶质瘤细胞U87、 T98G、U251、SNB19、GSC23、A172、LN229、G267和星形胶质细胞NHA中的FHL2蛋白表达水平。利用慢病毒载体构建稳定敲 低 FHL2 的 U87 细胞和过表达 FHL2 的 SNB19 细胞，即 U87-shGFP、U87-shFHL2-1#、U87-shFHL2-4#和 SNB19-3flag、SNB19- 3flag-FHL2组。通过CCK-8法、克隆形成实验检测敲低和过表达FHL2对细胞增殖的影响，免疫共沉淀（Co-IP）和液相色谱-串联 质谱（LC/MS）法筛选FHL2在胶质瘤细胞中的相互作用蛋白，并用Co-IP和免疫荧光法验证它们的结合作用和共定位情况。使用 酶标仪检测敲低和过表达FHL2细胞内乳酸产量和乳酸脱氢酶（LDH）活性的变化，WB法分析FHL2、LDHA及p-LDHA在正常脑 组织和胶质瘤组织中的蛋白表达差异及其相互关系。在过表达 FHL2的SNB19细胞中使用LDHA的小分子抑制剂AT-101，通过 CCK-8实验和酶标仪比色法验证 FHL2 在胶质瘤乳酸代谢中的作用 ，验证AT-101 在胶质瘤中潜在的治疗效果。结果： Co-IP和LC/MS检测发现 ，FHL2 与 LDHA 在胶质瘤细胞中存在相互作用。FHL2 过表达可提高 LDHA 活性和乳酸生成 （均P < 0.001），进而促进胶质瘤细胞增殖（P < 0.001）。相反，敲低FHL2会降低LDHA活性和乳酸产量（P < 0.001或P < 0.05）并 抑制细胞增殖（P < 0.001）。AT101能抑制LDHA活性，并显著抑制FHL2促进胶质瘤细胞的增殖，同时恢复磷酸化LDHA（Y10） 水平（P<0.01或P < 0.001）。结论：FHL2与LDHA蛋白相互作用，FHL2通过激活p-LDHA（Y10）的表达促进LDHA活性和乳酸 产生，进而促进胶质瘤细胞的增殖，靶向这种相互作用可能成为治疗胶质瘤的潜在策略。
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骨髓增生异常综合征去甲基化药物治疗的研究进展
王琳, 许小平
2012,19(5):550-555, DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2012.5.018
[摘要] (2458) [HTML] (0) [PDF 236.31 K] (42145)
摘要：
骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）的发病机制涉及多阶段、多因素，基因改变与表观遗传修饰可能共同参与了这一过程。DNA甲基化是表观遗传学中一种最为重要的修饰，MDS患者常表现为总体DNA高甲基化。使用DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）抑制剂降低总体甲基化水平，在MDS患者中取得了富有成效的临床反应及血液学改善。DNMT抑制剂可分为两类：5-氮杂胞苷(5-azacytidine, 5-Aza-CdR)、地西他滨（5-Aza-2-deoxycytidine, decitabine）等核苷和核苷衍生物类抑制剂，它们可提高MDS患者的临床完全反应率、部分反应率及血液学改善，但缓解率、疗效尚不够令人满意；肼苯哒嗪等非核苷类抑制剂。非核苷类抑制剂与丙戊酸镁联合应用治疗MDS获得成功，为MDS去甲基化治疗药物的研究开启了一种新思路。
肿瘤免疫细胞治疗的现状及展望
郭振红, 曹雪涛
2016,23(2):149-160, DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2016.02.001
[摘要] (3069) [HTML] (0) [PDF 440.97 K] (22615)
摘要：
肿瘤免疫细胞治疗近年来因其疗效显著而备受瞩目。免疫细胞，包括T细胞、NK细胞和DC在抗肿瘤免疫应答以及肿瘤免疫治疗中发挥了重要作用。其中，嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）修饰T细胞（CAR-T）技术和逆转肿瘤免疫抑制功能的CTLA-4和PD-1/PD-L1等免疫检查点抑制剂疗法分别在血液肿瘤及黑素瘤等实体肿瘤治疗中取得了令人振奋的效果，如何进一步提高疗效、增加适应性肿瘤病种并控制其免疫相关的不良反应成为日后研究重点；NK 细胞也将利用CAR技术和免疫检查点抑制剂进一步增强其在肿瘤治疗中的作用；DC作为第一个被FDA批准的治疗性肿瘤疫苗，在证明其安全无毒副作用的基础上，如何提高疗效成为关注热点。本文结合近年来肿瘤免疫细胞治疗的进展及该领域中亟需解决的问题作一分析与展望。
前列腺癌内分泌治疗及其全程管理
师菲, 夏术阶
2018,25(1):23-27, DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2018.01.004
[摘要] (994) [HTML] (0) [PDF 597.23 K] (11872)
摘要：
前列腺癌已成为我国男性常见病之一，内分泌治疗在前列腺癌（尤其是晚期前列腺癌）治疗中举足轻重，但在临床应用中出现的一系列分歧并没有解决。如何相对统一认识，进行合理的前列腺癌内分泌治疗的全程管理，让患者获得最佳疗效显得尤为重要。本文依据国内外指南以及临床试验结果，对目前前列腺癌内分泌治疗的一系列问题，如治疗时机、治疗方案、患者选择、预后随访等作了详细总结及分析。
包载TIMP-1重组腺病毒微球的制备及其对肝癌细胞增殖的抑制
夏 冬, 吴 斌, 梁建群, 余少鸿, 徐 亮
2010,17(1):57-61, DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2010.1.011
[摘要] (2737) [HTML] (0) [PDF 0.00 Byte] (11110)
摘要：
目的：制备携带人基质金属蛋白酶组织抑制因子 1（tissue inhibitors of metalloproteinase 1，TIMP 1）的重组腺病毒乳酸聚乙烯醇（poly DL lactide poly，PELA）微球，探讨其对HepG2肝癌细胞增殖的影响。方法：采用溶剂挥发法双乳液体系，以可降解的生物材料PELA包被携带TIMP 1基因的重组腺病毒制成微球，测定其粒径、载病毒量、包封率及释放规律。重组腺病毒微球感染HepG2细胞，荧光显微镜观测感染效率，透射电镜观测超微结构，半定量RT PCR检测TIMP 1 mRNA表达；MTT法检测HepG2细胞增殖。结果：成功构建包载TIMP 1重组腺病毒的PELA微球，直径约1.965 μm，包封率为60%，载病毒率为10.5×108efu/mg，在120 h内释放病毒量接近60%，总的释放时间长于240 h。空白微球无毒性PELA病毒微球感染HepG2细胞后，细胞稳定表达TIMP 1 mRNA；对HepG2细胞的增殖有明显抑制作用，抑制率表达47%。结论：包载TIMP 1重组腺病毒的PELA微球可抑制肝癌HepG2细胞的增殖，为化学高分子载体运载基因治疗肝癌提供了实验依据。